吳勤勤　蘇敏

摘? ?要：隨著脂肪酶在我們生產生活中的廣泛應用，人們越來越多地使用生物技術手段對酶蛋白的分子結構進行改造，以改善不同來源脂肪酶的性質，獲得更多滿足人類需求的脂肪酶。氧陰離子洞是脂肪酶活性中心“口袋”附近的催化元件，因此，在脂肪酶的催化反應過程中，氧陰離子洞結構發(fā)揮著很重要的作用，也為此成為研究的熱點。在過去的十多年里，人們更加關注對脂肪酶氧陰離子洞的研究并且取得了很大的進展，對此進行了研究和闡述。

關鍵詞：脂肪酶;氧隱離子洞;催化元件

1? ? 脂肪酶及氧陰離子洞簡介

脂肪酶（EC 3.1.1.3） 又稱三酯酰甘油?；饷?，是在油水界面中最具有活性的丙三醇酯水解酶。它們不僅能夠催化水解反應還能催化長鏈?；视偷暮铣?，在食品加工、洗滌、制藥、化工等領域都被廣泛的應用[1]。脂肪酶廣泛存在于自然界中，但是從自然界中直接分離純化得到的酶往往不能滿足生活、工業(yè)生產的需要，因此，通過實驗室改造獲得高性能、強實用性的脂肪酶，已成為一種有效的途徑。雖然不同脂肪酶的來源不同，并且它們的氨基酸序列也大不相同，但它們仍然有一些相同的結構。如都具有一個含有催化三連體（Ser-His-Asp/Glu）的催化中心[2];都具有一個特殊的序列-G X1 S X2 G-[3];都具有α/β水解酶折疊結構并且在一些其他的水解酶中它們的3-D折疊結構是相同的[4]。在脂肪酶未活化（處于水相或者有機相）時，其催化中心會被一個靈活的“蓋子”蓋住，阻止了底物與酶的活性中心接觸。在油-水界面上時，脂肪酶存在一種“界面激活”的現(xiàn)象。即在油-水界面處，脂肪酶的蓋子結構區(qū)域的構象會發(fā)生變化，從而使蓋子結構被打開，活性中心暴露出來，底物順利進入活性中心并與之結合，使脂肪酶的催化活性大幅度提升。當“蓋子”打開的同時，氧陰離子洞也隨之形成。氧陰離子洞是脂肪酶活性中心“口袋”附近的催化元件，由催化三連體中絲氨酸的側鏈或兩個主鏈酰胺基團組成[5]，在大多數(shù)情況下由來自兩個主鏈酰胺結合羰基氧形成的氫鍵來穩(wěn)定四面體中間產物[6]。根據氧陰離子洞的氨基酸組成，脂肪酶被分為3大類：GGG（X）- ，G（X）- 和Y-類[7]。依據一般分類，G（X）類由11個超家族和22個同源家族組成，其中包含376個蛋白質，具有6 004個序列和已知結構的125條鏈。該類主要包括細菌和真菌脂肪酶、真核脂肪酶、角質酶、磷脂酶和非血紅素過氧化物酶。GGG（X）類由5個超家族和16個同源家族組成，包括430個蛋白質，具有767個序列和73個已知結構的鏈。它包括細菌酯酶、真核羧酸酯酶、激素敏感脂肪酶、乙酰膽堿酯酶和硫酯酶等?！澳蠘O假絲酵母脂肪酶A”超家族，由于構成CAL-A氧陰離子洞氨基酸殘基為Tyr93，因此被分為Y型。它包含一個晶體結構，CAL-A和39個序列分配給32種蛋白質，它們都來自屬于真菌界的微生物。

酶的催化活性除受外界環(huán)境（溫度、pH、鹽離子等）影響外，其自身的活性中心、“蓋子”結構、?；诖?、氧陰離子洞等結構也都會影響酶對底物的催化能力[8]。因此，氧陰離子洞作為影響酶活性的重要因素被人們關注。研究學者在對酶性質研究的過程中，不僅改變脂肪酶“蓋子”結構的組成、鉸鏈區(qū)的氨基酸種類和酰基口袋的大小，還改變組成脂肪酶氧陰離子洞的氨基酸殘基。對組成脂肪酶氧陰離子洞氨基酸殘基的改造旨在得到符合人們要求的脂肪酶突變體，并將該突變體在食品、制藥、化工、洗滌劑等工業(yè)方面加以應用。

2? ? 脂肪酶氧陰離子洞結構的組成及改造研究

2.1? 關于脂肪酶氧陰離子洞結構的組成

氧陰離子洞作為影響脂肪酶催化活性的重要結構，成為人們研究的熱點。眾多研究發(fā)現(xiàn)，改變氧陰離子洞結構的氨基酸的組成，或者改變氧陰離子洞的類型，會對脂肪酶的底物特異性、熱穩(wěn)定性和催化活性等產生重大影響。人們對脂肪酶分子中氧陰離子洞結構組成的判斷，主要通過基因序列分析、X-射線晶體衍射技術、同源建模、酶活性中心分析等方法。如通過X-射線晶體衍射技術和酶活性中心分析得出法德氏根霉脂肪酶和雪白根霉脂肪酶的氧陰離子洞都可能由羥基和主鏈上的Thr 83所構成[9]。Seizaburo Shiraga等[10]通過晶體分析得知，米根霉脂肪酶的氧陰離子洞可能由Thr 93 和Asp 94構成。MaevaSubileau等[11]通過同源建模并對此加以分析得出G181和D90可能是構成平滑假絲酵母脂肪酶A（CAL-A）氧陰離子洞的氨基酸殘基。

2.2? 脂肪酶氧陰離子洞結構的改造

氧陰離子洞結構在酶的催化過程中具有重要的價值。近年來，隨著脂肪酶在生活中被廣泛應用，并且為了得到具有耐低溫、耐高溫、具有立體選擇性等特性的酶，人們對酶蛋白氧陰離子洞結構的改造研究日趨升溫。研究學者對酶結構的改造策略常有理性設計和定向進化。目前，國內外學者主要用理性設計這種方法對氧陰離子洞（oxyanion hole）進行改造。理性設計分為定點突變和定點飽和誘變，是經常用于改造氧陰離子洞結構的一種方法[12-14]，其原理是依據脂肪酶的三維結構，利用生物信息學分析酶蛋白分子結構和功能的關系，然后運用定點突變技術完成氨基酸殘基的替換[15]。

2.2.1? 定點突變

定點突變是較早用于改造脂肪酶的分子生物學手段。目前，人們仍利用該手段在酶分子的穩(wěn)定性、催化活性等方面進行成功的改造。為了研究角質酶分子中的Serine 42側鏈在穩(wěn)定四面體中間產物中的作用，Anne Nicolas等[5]通過定點突變的方法，將Serine 42突變?yōu)锳la，Asn84分別突變?yōu)锳la，Leu，Asp和Trp（因為Asn直接影響著Ser42Oγ恰當?shù)姆较颍?。結果顯示，野生型脂肪酶的活性與改造后的S42A突變體相比增加了450倍，但后者三維空間結構沒有發(fā)生改變。N 84 A和N 84 L突變體的活性及三維空間結構都沒有改變，但N 84 W 和N 84 D突變體幾乎喪失活性。表明Serine 42側鏈和其周圍的氨基酸殘基共同穩(wěn)定四面體中間產物;葡萄球菌CR53脂肪酶LipR有特殊的Y型氧陰離子洞序列，這在細菌脂肪酶中從未發(fā)現(xiàn)，為了探索這種不尋常的Y型氧陰離子洞結構在葡萄球菌CR53脂肪酶LipR催化活性中的作用。Belen Infanzon和Pablo H. Sotelo及其同事通過QuikChange?定點突變的策略[7]，將LipR Y型氧陰離子洞結構（YDS）轉變?yōu)楦咏毦心切┳畛Ｒ姷腉GG（X）結構。然而，在獲得的所有突變體中，活性完全喪失，表明LipR的Y型氧陰離子洞在酶催化活化中起著至關重要的作用。Amanda Fillat等 [12]為了提高EstBP7轉化TA酯的能力，就對-GGG（A）X-結構進行了定點突變，最終篩選到了一株，在4 ℃下對叔醇乙酸酯有很高對映選擇性的突變株。這一研究對制藥工業(yè)中有價值的光學純叔醇的生物催化有很大的意義。定點突變具有明確的目標位置，用以定向改變脂肪酶某些結構的氨基酸組成進而使其酶學性質發(fā)生改變，如提高其熱穩(wěn)定性、改變其對底物的對映選擇性等。經修飾改變后得到的脂肪酶更符合工業(yè)應用的需求，這是一種高效、簡潔的突變方法。

2.2.2? 定點飽和突變

定點飽和突變主要包括：聚合酶鏈式反應介導的定點突變、寡核苷酸引物介導的定點突變和盒式突變，其中最常用的方法是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）介導的定點突變。定點飽和突變是在酶與底物結合區(qū)內的位點上進行改造的主要策略，以改善有限的底物范圍、活性不足和穩(wěn)定性差等缺陷。該技術是在定點突變的基礎之上發(fā)展起來的，雖然通過定點突變已經在獲得具有改善催化性質的酶方面取得了許多成功，但仍然存在許多不確定性因素，因此，通過設計簡并引物實現(xiàn)定點飽和突變的方法得到了廣泛的應用。在簡并引物的設計過程中，根據密碼字的特點，最常用的系統(tǒng)為NNK，NDT，HCSM[16]，選擇合適的簡并引物系統(tǒng)，能夠有效地縮小所需要篩選的文庫，增加篩選的效率。Belen Infanzon[7]為了探究Y型氧陰離子洞在脂肪酶LipR催化活化中的作用，通過QuikChange?進行定點飽和誘變，用NNK簡并密碼子（N為A，T，G或C，K為G或T）替換目標密碼子，構建脂肪酶LipR的Y110和D111位置可能編碼所有氨基酸的兩個基因文庫。結果表明，當Tyr110被任何其他氨基酸取代時，獲得的LipR突變體都不具有活性。而突變體LipR D111G在短鏈或中鏈底物上顯示出比野生型LipR更低的活性，但在長鏈底物上的活性比野生型增加5.6倍。

3? ? 結語

在實際的生產當中，脂肪酶的用途十分廣泛，但其研發(fā)和應用受到許多因素的制約，如脂肪酶的選擇性及催化機制、價格昂貴、回收困難、穩(wěn)定性較差等。但隨著科學技術的進步和微生物脂肪酶的高速發(fā)展，這些限制因素成為國內外學者研究脂肪酶的熱門方向。人們越來越多地使用生物技術手段對酶蛋白的分子結構進行改造，以改善不同來源脂肪酶的性質，得到更多滿足人類需求的脂肪酶，達到利于人們生活、社會生產和人與自然和諧相處的目的。

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Research progress of lipase oxyanion hole

Wu Qinqin， Su Min

（Life Science College， Fujian Normal University， Fuzhou 350008， China）

Abstract： With the wide application of lipase in our production and life， people are increasingly using biotechnology to modify the molecular structure of enzyme proteins to improve the properties of lipases from different sources and to meet more human needs. The oxyanion hole is a catalytic element near the “pocket” of the lipase active center. Therefore， the oxyanion hole? structure plays an important role in the catalytic reaction of lipase， and it is also a research hotspot. In the past ten years， people have paid more attention to the study of lipase oxygen anion holes and made great progress.This paper studies and expounds this experiment.

Key words： lipase; oxyanion hole; catalytic element