韓利紅 劉潮 張維維 李發(fā) 鄧發(fā)虎 阮子恒

摘要：【目的】鑒定鐵皮石斛熱激轉錄因子（Hsf）基因家族成員，并進行生物信息學分析，為深入研究該家族在鐵皮石斛熱應激響應中的調控機制提供理論參考?！痉椒ā恳詳M南芥和水稻Hsf蛋白氨基酸序列為參考序列，在鐵皮石斛蛋白數(shù)據(jù)中搜索其同源蛋白序列，利用SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫鑒定出其Hsf基因家族成員。利用生物信息學方法對鐵皮石斛Hsf基因家族組成、基因結構、啟動子區(qū)順式作用元件及其編碼蛋白結構域和進化關系等進行分析?！窘Y果】共鑒定獲得23個鐵皮石斛Hsf基因家族成員，編碼氨基酸數(shù)量為132～514個，平均343個，多數(shù)屬于酸性蛋白和親水性蛋白，可分為HsfA、HsfB和HsfC組，其中HsfA組成員13個、HsfB組成員9個、HsfC組成員1個。除DoHsfA3僅包含motif 1和motif 2外，其他HsfA組蛋白均含有motif 1～motif 5，HsfB和HsfC組蛋白均缺少motif 5。鐵皮石斛Hsf蛋白缺少A9、B3、B5和C1亞類成員，與同屬于單子葉蘭科植物的小蘭嶼蝴蝶蘭Hsf蛋白親緣關系最近。HsfA組成員包含完整的HSF功能域和卷曲螺旋（CC）功能域，HsfB和HsfC組成員缺少或含不完整的CC功能域。DoHsfA1A蛋白具有保守的絲氨酸—苯丙氨酸—纈氨酸—精氨酸—谷氨酰胺序列。鐵皮石斛Hsf基因啟動子區(qū)含有大量激素響應、脅迫響應和生長相關元件。【結論】鐵皮石斛Hsf基因家族成員進化較保守，其生物學功能存在明顯物種特異性，進化關系較復雜，推測其在不同的非生物脅迫和植物激素信號途徑中發(fā)揮潛在“節(jié)點”作用。

關鍵詞： 鐵皮石斛;熱激轉錄因子（Hsf）;基因家族;系統(tǒng)發(fā)育進化樹;脅迫;順式作用元件

中圖分類號： S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0677-08

Abstract：【Objective】In this study，gene family members of heat shock transcription factors（Hsf） in Dendrobium officinale were identified and bioinformatics analysis was conducted. It provided? reference for studying the regulation me-chanism of this family in response of D. officinale to heat stress. 【Method】The amino acid sequences of Hsf protein in Arabidopsis thaliana and rice were as reference sequence，the homologous protein sequence was searched in D. officinale protein database，and the Hsf gene family members were identified by SMART and Pfam database. The member composition，gene structure，cis-acting elements of gene promoter， protein functional domain and evolution of D. officinale Hsf family were analyzed by bioinformatics methods. 【Result】A total of 23 Hsf gene family members were identified in D. officinale，the number of coding amino acids ranged from 132 to 514，with an average of 343，and most of them belonged to acidic and hydrophilic proteins. The proteins were divided into HsfA，HsfB and HsfC groups，members of each group were thirteen，nine and one，respectively. All HsfA group proteins contained motif 1-motif 5，except DoHsfA3 only contained motif 1 and motif 2. Proteins in HsfB and HsfC groups all lacked motif 5. D. officinale Hsf protein lacked members belonging to A9， B3， B5 and C1 subclasses. Their genetic relationship was close to Hsf protein of Phalaenopsis equestris belonging to monocotyledon Orchidaceae. HsfA group members included complete HSF domain and coiled helix（CC） domain，while the HsfB and HsfC groups contained incomplete or missing CC domain. DoHsfA1A protein had conservative serine-phenylalanine-valine-arginine-glutamine sequence and Lys80 residues. The promoter region of D. officinale Hsf genes contained a large number of hormone response， stress response and growth related elements. 【Conclusion】These results indicate that D. officinale Hsf gene family members are conservative? in evolution，with obvious species specificity in function and complex evolutionary relationship. It is speculated that they play a potential node role in different abiotic stresses and plant hormone signaling pathways.

Key words： Dendrobium officinale; heat shock transcription factor（Hsf）; gene family; phylogenetic tree; stress;cis-acting element

0 引言

【研究意義】鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，適宜生長于涼爽、濕潤、半陰濕的環(huán)境中，生長速度緩慢，對生長環(huán)境和氣候條件要求較苛刻，其莖可入藥，具有滋陰明目、潤肺益腎的功效，市場前景較好（蔣素華等，2017;冼康華等，2017;江愛明等，2018;曾貞等，2018）。植物在整個生命周期需應對多種生物和非生物脅迫而發(fā)生熱應激響應，從而產(chǎn)生熱激蛋白（Heat shock proteins，Hsp）等響應分子，該蛋白在植物細胞修復、蛋白折疊和降解及信號轉導過程中發(fā)揮重要作用（Al-Whaibi，2011）。在該響應過程中，熱激轉錄因子（Heat shock transcription factors，Hsf）是主要的調控因子，通過識別保守的熱應激元件直接激活Hsp的表達（陳曉軍等，2006;王海波等，2016）。研究鐵皮石斛Hsf蛋白對探究鐵皮石斛的應激反應機制具有重要意義。【前人研究進展】有關鐵皮石斛的研究主要集中在栽培技術、有效成分含量及產(chǎn)品開發(fā)等方面（Huang et al.，2016;Zhang et al.，2017）。隨著鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)的公布，對鐵皮石斛分子生物學方面的研究逐漸增多（Zhang et al.，2016;Wang et al.，2018;Yu et al.，2018），但對Hsf蛋白家族研究主要集中于擬南芥（Guo et al.，2008）、水稻（Guo et al.，2008）、大豆（Scharf et al.，2012）、大白菜（Song et al.，2014）、辣椒（Guo et al.，2015）、梨（Qiao et al.，2015）、楊樹（Zhang et al.，2015）等植物，其原因是這些植物基因組數(shù)據(jù)公布相對較早，為該家族的研究提供了條件。目前，對植物細胞的應激反應系統(tǒng)已有了深入了解，且研究發(fā)現(xiàn)，熱應激可誘導Hsp蛋白家族持續(xù)表達，但Hsf蛋白可抑制Hsp基因的轉錄（Pratt et al.，2010）。典型的植物Hsf蛋白具有DNA結合功能域（DBD）、寡聚化功能域（OD）、核定位信號（NLS）和核輸出信號（NES），其中DBD位于Hsf蛋白的N端，由H1、H2和H3等3個α螺旋和1個β片層組成（Schultheiss et al.，1996），可特異性識別熱激響應元件（5'-AGAA nnTTCT-3'）（?kerfelt et al.，2010）。根據(jù)OD序列的特異性，可將Hsf分為HsfA、HsfB和HsfC 3組，不同植物中Hsf的數(shù)量及各組組成有明顯差異，如擬南芥中有21個Hsf蛋白，而大豆中有52個Hsf蛋白，且在進化過程中各組的成員數(shù)量和組成會發(fā)生改變，可能是由物種間全基因組復制事件差異造成（Scharf et al.，2012）。相比于裸子植物和被子植物間的Hsf蛋白家族差異，單子葉和雙子葉植物間的Hsf蛋白家族差異較少，如Hsf蛋白的A9、B3和B5亞類僅存在于雙子葉植物中（Scharf et al.，2012）。大量研究表明，擬南芥的熱激響應調控網(wǎng)絡中，作為主要調控因子的熱激轉錄因子HsfA1s可能通過調控DREB2A、HsfA2、HsfA7a、HsfBs和MBF1C等基因的轉錄在植物熱應激響應中發(fā)揮作用（Liu et al.，2011;Yoshida et al.，2011;Ohama et al.，2017）。擬南芥HsfA2基因在光照、熱激和H2O2處理下表達上調，其編碼蛋白是多種環(huán)境脅迫信號的防御誘導因子（Zhang et al.，2009）。番茄中HsfA2受熱激誘導表達，可與HsfA1形成異源寡聚物，增強其調控能力（Chan-Schaminet et al.，2009）。Hsf可調控Hsp表達，同時也受Hsp的反饋調控作用，如番茄Hsp70通過物理作用抑制HsfA1和HsfB1活性（Hahn et al.，2011）。此外，辣椒中大部分Hsf能響應熱激、高鹽和滲透脅迫，其中HsfA1、HsfA6a、HsfA9a和HsfB1基因在多個組織中持續(xù)高效表達（Guo et al.，2015）。【本研究切入點】目前，鮮見有關鐵皮石斛Hsf基因家族的研究報道。【擬解決的關鍵問題】通過生物信息學軟件對鐵皮石斛Hsf基因家族組成、結構、進化和啟動子區(qū)元件進行分析，以期揭示鐵皮石斛Hsf基因家族的特征，為深入研究該家族在鐵皮石斛熱應激響應中的調控機制提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 鐵皮石斛Hsf基因家族成員鑒定

從NCBI網(wǎng)站GenBank搜索下載擬南芥和水稻Hsf蛋白的氨基酸序列，將其作為參考序列，在鐵皮石斛蛋白數(shù)據(jù)中搜索其同源蛋白序列。利用SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫對獲得的Hsf蛋白序列進行HSF保守結構域（PF00447）鑒定。利用ExPASy ProtParam對蛋白理化性質進行預測。

1. 2 鐵皮石斛Hsf基因家族結構和蛋白保守基序分析

使用基因結構顯示系統(tǒng)GSDS 2.0繪制鐵皮石斛Hsf基因家族的基因結構示意圖。使用MEME 5.0.2對鐵皮石斛Hsf蛋白的保守基序進行分析，基序搜索數(shù)目為5，其他參數(shù)為默認設置。利用SWISS-MODEL預測蛋白的三維結構，并使用VMD 1.9.1實現(xiàn)蛋白三維結構的可視化。

1. 3 鐵皮石斛Hsf基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

從PlantTFDB 4.0數(shù)據(jù)庫下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）Hsf蛋白序列，并利用SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫對其進行HSF保守結構域（PF00447）鑒定。利用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap值為1000。

1. 4 鐵皮石斛Hsf基因家族成員啟動子區(qū)順式作用元件分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫獲取鐵皮石斛Hsf基因家族成員轉錄起始位點上游1.5 kb序列，并通過PlantCARE在線數(shù)據(jù)庫對啟動子區(qū)的順式作用元件進行分析。

2 結果與分析

2. 1 鐵皮石斛Hsf基因家族成員的鑒定及理化性質預測結果

以擬南芥和水稻Hsf蛋白的氨基酸序列為參考序列，搜索獲得鐵皮石斛同源蛋白序列，去除不含HSF結構域和重復冗余的Hsf蛋白后，共獲得23個鐵皮石斛Hsf基因家族成員，經(jīng)SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫鑒定發(fā)現(xiàn)均具有HSF保守結構域，最后根據(jù)進化分組對其進行命名（表1），其中有13個HsfA組成員、9個HsfB組成員和1個HsfC組成員，但僅HsfA組成員包含完整的CC功能域，HsfB和HsfC組成員缺少或含不完整的CC功能域。鐵皮石斛Hsf蛋白的氨基酸數(shù)量為132～514個，平均343個，分子量為15147.48～56695.63 Da，理論等電點（pI）4.76～9.10，73.91%屬于酸性蛋白，除DoHsfA3外，其他鐵皮石斛Hsf蛋白總平均疏水指數(shù)均為負值，屬于親水蛋白。

2. 2 植物Hsf蛋白的系統(tǒng)進化關系分析結果

為了解植物Hsf基因家族的系統(tǒng)進化關系，本研究使用MEGA 6.0基于鐵皮石斛、擬南芥、水稻和小蘭嶼蝴蝶蘭Hsf蛋白的HSF保守功能域序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果如圖1所示。HsfA組成員數(shù)量最多，可分為A1～A9亞類，其次為HsfB組，可分為B1～B4亞類，HsfC組成員數(shù)最少，可分為C1和C2亞類。鐵皮石斛的13個HsfA組成員分布在A1～A8亞類，其中A1亞類中3個成員，A2亞類中4個成員，A4和A5亞類中各有2個成員，A3和A8亞類中各有1個成員。鐵皮石斛的9個HsfB組成員分布在B1、B2和B4亞類中，其中B2和B4亞類中均有4個成員，B1亞類中有1個成員。鐵皮石斛的1個HsfC組成員（DoHsfC2）位于C2亞類。擬南芥、水稻和小蘭嶼蝴蝶蘭中Hsf蛋白各組的成員數(shù)量與鐵皮石斛相似，且同樣表現(xiàn)為HsfA組成員數(shù)量最多，HsfB組次之，HsfC組成員數(shù)量最少?？梢姡F皮石斛Hsf蛋白缺少A9、B3、B5和C1亞類的成員，與同屬于單子葉蘭科植物的小蘭嶼蝴蝶蘭Hsf蛋白親緣關系最近。

2. 3 鐵皮石斛Hsf基因結構及其編碼蛋白的保守基序分析結果

利用GSDS 2.0繪制鐵皮石斛Hsf基因結構示意圖（圖2），結果發(fā)現(xiàn)有17個Hsf基因僅含1個內含子，4個Hsf基因含2個內含子，2個Hsf基因無內含子，其中僅含1個內含子的Hsf基因中，內含子為0型、1型和2型相位的數(shù)目分別為2、7和8個。A1、A2和A8亞類中多個成員具有較大的內含子。

使用MEME 5.0.2對23個鐵皮石斛Hsf蛋白保守基序進行分析（圖2），結果發(fā)現(xiàn)5個基序（motif 1～motif 5）保守性較強;除DoHsfA3僅包含motif 1和motif 2外，其他HsfA組蛋白均含motif 1～motif 5，HsfB和HsfC組蛋白均缺少motif 5，DoHsfB2B和DoHsfC2僅包含motif 1～motif 3。其中，motif 1～motif 3共同構成了HSF保守功能域，保證蛋白的特異性結合DNA功能。motif 4和motif 5共同構成了卷曲螺旋功能域，可能在信號激活中發(fā)揮作用（Maekawa et al.，2011）。

利用SWISS-MODEL預測23個鐵皮石斛Hsf蛋白的三維結構，使用VMD 1.9.1進行可視化，結果發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛HsfA組蛋白結構較完整，其中DoHsfA1A蛋白（圖3）與乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）Hsf1蛋白類似，其68～72位置上有保守的絲氨酸—苯丙氨酸—纈氨酸—精氨酸—谷氨酰胺序列，其可識別并插入至DNA熱激元件的溝槽中，序列中的精氨酸（Arg71）殘基通過與nGAAn元件中的鳥嘌呤形成氫鍵實現(xiàn)與DNA的結合（Littlefield and Nelson，1999）。由此推測DoHsfA1A蛋白的Arg71在蛋白與DNA的結合中發(fā)揮作用。

2. 4 鐵皮石斛Hsf基因啟動子區(qū)順式作用元件分析結果

為了解鐵皮石斛Hsf基因在植物生長發(fā)育中的作用及對脅迫響應的能力，使用PlantCARE對鐵皮石斛Hsf基因啟動子區(qū)順式作用元件進行預測，結果如表2所示。除了最基本的TATA-box和CAAT-box外，鐵皮石斛Hsf基因啟動子區(qū)含大量的激素響應、脅迫響應和生長相關元件，其中啟動子區(qū)含脫落酸響應元件（ABRE）的Hsf基因占56.5%，含茉莉酸響應元件（CGTCA-motif）的Hsf基因占65.2%，含赤霉素響應元件（TATC-box和P-box）和水楊酸響應元件（TCA-element）的Hsf基因占34.8%，含生長素響應元件（TGA-element）的Hsf基因占17.4%，含厭氧誘導必需的順式作用元件（ARE）的Hsf基因占73.9%，含脫水響應相關元件（MYB-like sequence）的Hsf基因占47.8%，含干旱響應MYB結合元件（MBS）、低溫響應元件（LTR）、損傷響應元件（WUN-motif）及防御和脅迫響應元件（TC-rich repeats）的Hsf基因均占21.7%，含病原激發(fā)子響應元件（W box）的Hsf基因占26.1%。除此之外，34.8%和21.7%的Hsf基因啟動子區(qū)分別含分生組織表達相關順式調控元件（CAT-box）和胚乳表達相關順式調控元件（GCN4_motif）等。

3 討論

高溫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要影響因素，通過干擾植物細胞的生理和代謝阻礙植物的生長發(fā)育，從而導致作物減產(chǎn)（Bita and Gerats，2013）。研究表明，植物Hsf基因可增強植物的耐熱性，響應多種非生物脅迫，從而保護機體免受應激損傷，并在其他許多生物學過程中發(fā)揮重要作用（Xin et al.，2010;Scharf et al.，2012;Xue et al.，2014）。多種植物的Hsf基因家族成員已被鑒定，如擬南芥（21個）、水稻（25個）、番茄（24個）、辣椒（25個）、楊樹（28個）、大豆（52個）、小麥（56個）等（Scharfet al.，2012;Xue et al.，2013;Fragkostefanakis et al.，2015;Guo et al.，2015;Zhang et al.，2015）。除Scharf等（2012）報道的21個擬南芥Hsf基因家族成員外，本研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥Hsf基因家族還有一個新成員At4g18870，該蛋白含有2個HSF結構域。Hsf基因家族成員數(shù)量與物種基因組大小不相關，如水稻、番茄和辣椒基因組大小分別為466 Mb、900 Mb和3.14 Gb，而Hsf基因家族成員數(shù)卻相差不大，分別為25、24和25個。鐵皮石斛基因組為1.35 Gb，介于番茄和辣椒基因組大小之間，其Hsf基因家族成員數(shù)量（23個）與二者的Hsf基因家族成員數(shù)量相當，但與基因組為1.10 Gb的大豆Hsf基因家族成員數(shù)量（52個）相差較大。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物Hsf基因家族成員數(shù)量除取決于基因組復制事件外，很可能與植物進化過程中所受的選擇壓力有關（Scharf et al.，2012）。

植物Hsf蛋白存在保守的功能域，包括N端的HSF功能域和中部的CC功能域，其中，HSF功能域含有DBD，其在DNA的特異性結合中發(fā)揮作用，CC功能域可能在信號激活中發(fā)揮作用（Maekawa et al.，2011）。Guo等（2016）研究認為Hsf蛋白的A9、B3和B5亞類成員僅限于雙子葉植物，而HsfC2亞類成員屬于單子葉特異型，與本研究結果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，歸屬于單子葉植物的鐵皮石斛同樣缺少Hsf蛋白的A9、B3和B5亞類成員，但含C2亞類成員。且系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果顯示，鐵皮石斛Hsf蛋白與同屬于單子葉蘭科植物的小蘭嶼蝴蝶蘭Hsf蛋白親緣關系最近，與物種的進化關系一致。

植物HsfA組蛋白是熱應激響應的主要調控因子，尤其是A1和A2亞類（Mishra et al.，2002;Zhu et al.，2006）。本研究DoHsfA1A蛋白三維結構顯示，其具有典型的DNA結合保守序列。Jaeger等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，Hsf蛋白A1亞類的賴氨酸（Lys80）發(fā)生乙酰化后，其電荷發(fā)生改變，進而抑制該類蛋白與DNA結合。由此推測DoHsfA1A蛋白活性受Lys80乙?；饔玫目刂啤？梢姡琀sf基因家族在植物機體中的調控機制非常復雜。此外，HsfB組蛋白可能缺乏激活功能域，無法獨立發(fā)揮功能活性，但其能通過與HsfA組蛋白形成復合體而發(fā)揮作用（Scharf et al.，2012;Fragkostefanakis et al.，2015）。鐵皮石斛Hsf蛋白均含有保守的HSF結構域，但僅HsfA組成員包含完整的CC功能域，HsfB和HsfC組缺少或含不完整的CC功能域，可能與不同組成員的功能活性有關。綜上所述，Hsf基因家族成員的生物學功能存在明顯物種特異性，進化關系較復雜。

大量研究表明，Hsf蛋白在植物響應非生物脅迫和激素信號中發(fā)揮作用（Xue et al.，2013;Fragkostefanakis et al.，2015;Guo et al.，2015;Huang et al.，2015;Zhang et al.，2015）。啟動子區(qū)的順式作用元件可調控基因的轉錄活性，通過分析順式作用元件組成，可了解基因的功能及其表達潛力。鐵皮石斛Hsf基因家族成員的啟動子區(qū)含大量激素響應、脅迫響應和生長相關元件，且含順式作用元件的種類和數(shù)量不盡相同，存在順式作用元件的重疊和交叉現(xiàn)象，推測該家族成員在不同的非生物脅迫和植物激素信號途徑中發(fā)揮潛在的“節(jié)點”作用，說明其可能同時調節(jié)多種非生物脅迫和植物激素信號通路，體現(xiàn)了該基因家族生物學功能的多樣性和復雜性。

4 結論

鐵皮石斛Hsf基因家族成員進化上保守，其生物學功能存在明顯物種特異性，進化關系較復雜，推測其在不同的非生物脅迫和植物激素信號途徑中發(fā)揮潛在“節(jié)點”作用。

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（責任編輯 陳 燕）