井崗山 張哲

[摘要]目的?探討細(xì)胞周期檢測點激酶2（CHK2）在膀胱癌組織中表達(dá)及臨床意義。方法?分別采用實時熒光定量PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)法，檢測73例膀胱癌及癌旁組織中CHK2基因和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果?膀胱癌組織中CHK2 mRNA相對表達(dá)量低于癌旁組織，膀胱癌組織中CHK2蛋白陽性表達(dá)率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.146，χ2=49.936，P<0.05）;膀胱癌組織中CHK2 mRNA相對表達(dá)量和CHK2蛋白陽性表達(dá)均與pT分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和P53蛋白表達(dá)有關(guān)（t=2.347～9.217，χ2=4.171～33.400，P<0.05）;CHK2蛋白陰性表達(dá)組病人平均生存時間47.25個月，CHK2蛋白陽性表達(dá)組病人平均生存時間67.24個月，Log-Rank檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.269，P<0.05）。結(jié)論?CHK2在膀胱癌組織中呈低表達(dá)，且與病人預(yù)后有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]膀胱腫瘤;細(xì)胞周期檢測點激酶2;病理學(xué)，臨床

[中圖分類號]R737.14;R365

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]?2096-5532（2019）05-0510-04

doi：10.11712/jms201905002

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，由于膀胱癌多呈浸潤性生長，術(shù)后具有較高的復(fù)發(fā)率[1]，嚴(yán)重威脅人類的健康。研究表明，細(xì)胞周期異常在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2]。細(xì)胞周期檢測點激酶2（CHK2）是調(diào)控細(xì)胞周期的主要激酶之一，與細(xì)胞周期穩(wěn)定、DNA修復(fù)、基因組平衡等密切相關(guān)[3-5]。CHK2參與了多種惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過程[6]。實驗研究結(jié)果顯示，RPA介導(dǎo)的膀胱癌TSGH-8301細(xì)胞生長抑制與CHK2激活相關(guān)[7]。但CHK2與膀胱癌臨床病理特征及病人預(yù)后間的關(guān)系鮮有報道。本研究對膀胱癌組織中CHK2基因及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，探討其與臨床病理特征之間的相關(guān)性及對預(yù)后的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1?資料與方法

1.1?一般資料

2010年3月-2012年3月，我院收治的膀胱癌病人73例，術(shù)前均未行放化療，術(shù)后經(jīng)病理活檢證實為原發(fā)性尿路上皮性癌。73例病人，男性62例，女性11例;年齡28～81歲，平均年齡（61.7±11.4）歲。均于術(shù)中留取膀胱癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣>2 cm），組織標(biāo)本分兩份，其中1份用40 g/L甲醛溶液固定，石蠟包埋;另1份快速置于液氮中，保存于-70 ℃冰箱以備檢。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有病人均知情同意。

1.2?方法

1.2.1?實時熒光定量PCR技術(shù)檢測膀胱癌及癌旁組織中CHK2基因表達(dá)?分別取膀胱癌及癌旁組織，研磨，用Trizol總RNA提取試劑盒（購自美國Gibco公司）提取組織細(xì)胞中總RNA。利用紫外線分光光度計檢測總RNA純度和濃度，以A260/A2801.80～2.20作為合格。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自大連寶生物公司）逆轉(zhuǎn)錄，用PCR試劑盒（購自日本TaKaRa公司）進(jìn)行擴(kuò)增。引物種類及其序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，72 ℃、6 min，連續(xù)進(jìn)行36次循環(huán)。每個樣品均設(shè)3個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法計算膀胱癌及癌旁組織中CHK2基因相對表達(dá)量。

1.2.2?免疫組化染色檢測膀胱癌及癌旁組織中CHK2蛋白表達(dá)?取石蠟包埋組織標(biāo)本，切片，常規(guī)脫蠟、水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，用體積分?jǐn)?shù)為0.03的過氧化氫溶液封閉，山羊血清封閉25 min。加入一抗兔抗人CHK2多克隆抗體（購自武漢博士德公司，稀釋比例1∶200），4 ℃下過夜孵育。加入二抗，室溫下孵育60 min，加入DAB，蘇木精復(fù)染，脫水、封片，觀察。用雙盲法分別由兩位具有副高級以上職稱醫(yī)師觀察，按照文獻(xiàn)的方法[8]判定結(jié)果。①染色范圍：0分，無染色;1分，陽性染色細(xì)胞比例<25%;2分，陽性染色細(xì)胞比例26%～50%;3分，陽性染色細(xì)胞比例51%～75%;4分，陽性染色細(xì)胞比例>75%。②染色強(qiáng)度：0分，無著色;1分，染色淺黃色;2分，染色黃色或棕色;3分，染色棕褐色。③染色指數(shù)：取①+②之和，0級，≤2分;1級，3～4分;2級，5～6分;3級，7分。根據(jù)染色指數(shù)對結(jié)果進(jìn)行判定：陰性，0級或1級;陽性，2級或3級。

1.2.3?病例隨訪?所有病人均進(jìn)行隨訪，隨訪形式包括門診和電話，隨訪截止日期2017年3月31日，隨訪過程中未出現(xiàn)失訪病例。

1.3?統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件完成數(shù)據(jù)整理和分析。計量資料采用[AKx-D]±s表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier法，生存曲線比較采用Log-Rank檢驗。以P<0.05為差異有顯著意義。

2?結(jié)果

2.1?膀胱癌及癌旁組織CHK2基因和蛋白表達(dá)的比較

膀胱癌組織中CHK2 mRNA相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.146，P<0.05）。膀胱癌組織中CHK2蛋白的陽性表達(dá)率低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=49.93，P<0.05）。見表2和圖1。

2.2?膀胱癌組織CHK2基因和蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

膀胱癌組織中CHK2 mRNA的相對表達(dá)量和CHK2蛋白陽性表達(dá)均與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量和分級無關(guān)（t=0.239～1.182，χ2=0.066～1.003，P>0.05），而與pT分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和P53蛋白的表達(dá)有關(guān)（t=2.347～9.217，χ2=4.171～33.400，P<0.05）。見表3。

2.3?膀胱癌組織中CHK2蛋白表達(dá)對病人預(yù)后的影響

本文73例膀胱癌病人中，截至2017年3月31日，最短生存時間5個月，最長84個月。CHK2蛋白陰性表達(dá)組病人的平均生存時間為47.25個月，而陽性表達(dá)組病人的平均生存時間為67.24個月，Log-Rank檢驗顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.269，P<0.05）。見圖2。

3?討論

膀胱癌作為一種男性高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病過程較為復(fù)雜，涉及多因素、多步驟[9-11]，其中，細(xì)胞周期調(diào)控異常在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[12-14]。CHK2是一種細(xì)胞周期檢查點激酶，在DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、染色體組裝及穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[15-17]。有研究表明，CHK2表達(dá)異常會影響細(xì)胞周期及細(xì)胞修復(fù)而導(dǎo)致癌變風(fēng)險增加[18-20]。CHK2在腫瘤發(fā)生中的作用尚存在爭議，CHK2在乳癌[21]、肺癌[22]、結(jié)直腸癌[23]等惡性腫瘤中表達(dá)缺失，可能發(fā)揮抑癌基因的作用;但CHK2在胃癌、食管癌、肝癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[24-26]，可能發(fā)揮癌基因的作用。本研究顯示，CHK2在膀胱癌組織中呈低表達(dá)，提示CHK2可能在膀胱癌發(fā)生中發(fā)揮抑制作用。

本研究結(jié)果顯示，CHK2 mRNA相對表達(dá)量和CHK2蛋白陽性表達(dá)在pT分期T2～T4期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、P53蛋白陽性的膀胱癌組織中呈低表達(dá)，進(jìn)一步說明CHK2低表達(dá)可促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展，提示CHK2可能充當(dāng)抑制腫瘤發(fā)生的角色而參與膀胱癌發(fā)生、進(jìn)展過程。有研究指出，抑癌基因p53是DNA損傷反應(yīng)中CHK2關(guān)鍵性作用靶點，CHK2在保證p53穩(wěn)定及積累中發(fā)揮重要作用[27]。p53是一種抑癌基因，但經(jīng)免疫組化檢測到的均為突變型p53，因此與文獻(xiàn)[27]不同，突變型p53對CHK2有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[28]。本研究顯示P53蛋白陽性表達(dá)的膀胱癌組織中CHK2呈低表達(dá)，也從另一個方面說明CHK2高表達(dá)對維持P53蛋白穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，CHK2蛋白陰性表達(dá)組病人平均生存時間短于陽性表達(dá)組，表明CHK2蛋白表達(dá)與膀胱癌病人預(yù)后有關(guān)，CHK2高表達(dá)可能預(yù)示著病人預(yù)后較好。

綜上所述，CHK2在膀胱癌組織中呈低表達(dá)，可能由于其發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用而參與膀胱癌發(fā)生、進(jìn)展過程，且與病人預(yù)后相關(guān)，有望為膀胱癌診療提供新的靶位和思路。

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（本文編輯?牛兆山?于國藝）