王東 劉國新 董作青 楊中軍 陳健

[摘要]目的?通過生物信息學分析，篩選舌鱗狀細胞癌（鱗癌）組織和正常組織差異表達基因（DEGs），篩選關(guān)鍵基因，為進一步的研究提供參考。方法?從公共基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO）下載舌鱗癌芯片數(shù)據(jù)，利用R語言Limma程序包篩選DEGs，利用韋恩圖篩選不同數(shù)據(jù)集的共同DEGs，對共同DEGs進行GO和KEGG富集分析、蛋白相互作用網(wǎng)絡分析及網(wǎng)絡關(guān)鍵基因生存分析。結(jié)果?篩選出不同數(shù)據(jù)集的共同DEGs 297個，這些基因參與血管新生、細胞黏附、氧化還原等過程，并參與細胞外基質(zhì)受體相互作用通路、黏著斑通路、小細胞肺癌通路、Toll樣受體信號通路和代謝通路，與舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時篩選出THBS1、CRP、HMMR、TFPI2、SDS、ANLN等6個關(guān)鍵基因，其表達上調(diào)，與頭頸部鱗癌病人的預后顯著相關(guān)。結(jié)論?篩選出的關(guān)鍵基因有助于加深對舌鱗癌發(fā)生發(fā)展分子機制的理解，同時可為后續(xù)的臨床研究提供一定的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]舌腫瘤;癌，鱗狀細胞;寡核苷酸序列分析;計算生物學;數(shù)據(jù)挖掘

[中圖分類號]R739.86

[文獻標志碼]A

[文章編號]?2096-5532（2019）05-0505-05

doi：10.11712/jms201905001

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有所上升。雖然現(xiàn)階段以手術(shù)為主的綜合治療取得了一定的效果，但是舌癌易轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除難度大，術(shù)后易復發(fā)，手術(shù)常常造成病人語言、進食、呼吸等功能的障礙和顏面的畸形[1-2]。目前舌癌的發(fā)病機制尚未明確。因此，在分子層面上揭示舌癌的發(fā)病機制，篩選舌癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，可能為舌癌的防治提供重要的靶點和標志物?；蛐酒且环N高通量獲取生物信息的技術(shù)，能高效檢測并分析腫瘤組織和正常組織差異表達基因（DEGs）[3]。本研究擬通過分析基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO）提供的舌鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，篩選DEGs，并對DEGs進行功能富集分析，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡，同時對關(guān)鍵基因進行生存分析，為進一步在分子水平研究舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制，為舌鱗癌的診斷和治療提供一定的理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1?資料和方法

1.1?數(shù)據(jù)檢索

在GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中檢索“tongue cancer”，下載舌鱗癌基因芯片數(shù)據(jù)。每個數(shù)據(jù)集均需符合以下條件：①實驗用人舌鱗癌組織和正常組織進行比較;②數(shù)據(jù)集來自全基因組 RNA 表達芯片。

1.2?獲得DEGs

應用R語言（https：//www.r-project.org/）對基因芯片原始數(shù)據(jù)進行注釋和過濾，用Bioconductor（http：//bioconductor.org/）提供的RMA算法對各原始芯片數(shù)據(jù)進行背景校正及歸一化等預處理。采用Limma程序包對腫瘤組織和正常組織樣本的基因表達值進行比對，以表達倍數(shù)變化值的對數(shù)值（log2FC）絕對值>1且調(diào)整后P<0.05為閾值，獲得各數(shù)據(jù)集的DEGs。采用韋恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）的方法獲取各數(shù)據(jù)集的共同DEGs。

1.3?GO和KEGG富集分析

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對各數(shù)據(jù)集的共同DEGs進行GO分析和KEGG分析。

1.4?蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）對各數(shù)據(jù)集共同DEGs編碼蛋白的相互作用進行網(wǎng)絡分析。應用Cytoscape_v3.6.1軟件插件Cytohubba尋找蛋白相互作用網(wǎng)絡中與舌鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1.5?關(guān)鍵基因生存分析

利用KM plotter網(wǎng)上分析工具（http：//kmplot.com/analysis/）分析DEGs表達與頭頸部鱗癌病人生存期的相關(guān)性，評價通過生物信息學方法找到的關(guān)鍵基因?qū)膊☆A后的預測能力。登錄KM plotter網(wǎng)站，輸入基因名稱，選擇疾病類別，樣本數(shù)設為499，cut off值設為median，繪制生存曲線，篩選有顯著統(tǒng)計學意義的結(jié)果。統(tǒng)計學處理的結(jié)果以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果

2.1?數(shù)據(jù)庫檢索

共檢索到3個數(shù)據(jù)集（GSE31056、GSE78060、GSE34105），其中GSE31056數(shù)據(jù)集包含24個正常樣本和24個腫瘤樣本;GSE78060數(shù)據(jù)集包含4個正常樣本和26個腫瘤樣本;GSE34105數(shù)據(jù)集包含16個正常樣本和62個腫瘤樣本。

2.2?DEGs分析

GSE31056、GSE78060和GSE34105基因芯片數(shù)據(jù)集分別篩選出DEGs為2 193、4 727和3 099個（圖1A～C）。為了減少DEGs篩選結(jié)果的假陽性率，采用韋恩圖取交集的方法確定3個數(shù)據(jù)集的共同DEGs為297個（圖1D）。

2.3?共同DEGs的GO和KEGG分析

GO分析包括生物學過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）3部分。DEGs的BP主要富集于血管新生、細胞黏附、氧化還原過程、正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶Ⅱ啟動子;CC主要富集于朊蛋白細胞外基質(zhì)、細胞外間隙、細胞外泌體、細胞外組分、細胞表面;MF主要富集于金屬內(nèi)肽酶活化、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、血紅蛋白結(jié)合、蛋白結(jié)合。KEGG分析顯示，通路主要富集于細胞外基質(zhì)受體相互作用通路、黏著斑通路、小細胞肺癌通路、Toll樣受體信號通路和代謝通路。見表1。

2.4?蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

設置最低要求的相互作用分數(shù)為0.4，得到297個共同DEGs編碼蛋白的相互作用關(guān)系圖（圖2）。采用 Cytoscape_v3.6.1 軟件的插件MCODE對該蛋白相互作用網(wǎng)絡進行分析，得到了由34個共同DEGs構(gòu)成的核心模塊（圖3）。對該核心模塊進行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其參與的重要BP主要是細胞黏附、正向調(diào)控基因表達作用，參與的主要信號通路有代謝和PI3K-Akt信號通路等。利用 Cytoscape_v3.6.1 軟件插件 cytohubba，采用Degree算法得到25個在共同DEGs編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡中的關(guān)鍵節(jié)點基因（圖4）。

2.5?生存分析

利用KM plotter網(wǎng)上分析工具分析關(guān)鍵基因表達與頭頸部鱗癌病人生存期的相關(guān)性，結(jié)果顯示，THBS1（HR=1.19～2.42，P<0.01）、CRP（HR=1.70～2.03，P<0.01）、HMMR（HR=1.10～1.88，P<0.01）、TFPI2（HR=1.00～1.73，P<0.05）、SDS（HR=1.03～1.80，P<0.05）、ANLN（HR=1.03～1.79，P<0.05）基因的表達與頭頸部鱗癌病人的預后顯著相關(guān)，這6個關(guān)鍵基因表達越高，病人預后越差（圖5）。

3?討論

本研究對GEO中檢索到的3個舌鱗癌相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集進行DEGs篩選，并對DEGs功能進行富集分析，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡分析關(guān)鍵基因表達與頭頸部鱗癌病人生存期的相關(guān)性，最終篩選出6個與舌鱗癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因。

THBS1是血小板反應蛋白家族中第一個被識別的蛋白，在腫瘤微環(huán)境中起重要作用。THBS1最開始是作為細胞黏附蛋白而被人們所關(guān)注，很多研究發(fā)現(xiàn)THBS1可以在不同種群的多種細胞中調(diào)節(jié)細胞黏附[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，THBS1表達上調(diào)可以增強腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，在乳癌中，THBS1FAK信號通路與Hippo信號通路交互作用來調(diào)控YAP相關(guān)的腫瘤侵襲。鑒于其在腫瘤進展中的重要作用，THBS1有望成為腫瘤治療的靶點[5]。

CRP即C反應蛋白，是肝臟產(chǎn)生的血液檢查炎性標志物，在炎癥狀態(tài)時表達升高，在宿主防御感染過程中起到關(guān)鍵作用[6]。PETRZYK等[7]研究表明，在結(jié)直腸癌中，肥胖相關(guān)的慢性炎癥可以通過活化JAK/STAT、MAPK、PI3K、mTOR等信號通路來誘導腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。還有研究結(jié)果表明，炎癥狀態(tài)和血漿CRP升高對多種腫瘤產(chǎn)生影響，炎性標志物表達與結(jié)直腸癌病人轉(zhuǎn)移生存率呈負相關(guān)[8]。

HMMR是細胞外基質(zhì)的主要成分，可以調(diào)節(jié)細胞運動和細胞周期[9]。STEVENS等[10]報道，在原發(fā)性肺腺癌中HMMR呈高表達。WANG等[11]報道，在乳癌中RHAMM呈過表達，RHAMM高表達與較差預后評估值相一致。HMMR參與了調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，其高表達提示腫瘤病理分期更差、預后更差。

TFPI2的生物學功能尚沒有完全確定。有學者認為TFPI2作為視網(wǎng)膜色素上皮細胞和血管平滑肌細胞的有絲分裂原來發(fā)揮作用[12-13]。在癌癥生物學背景下，關(guān)于TFPI2的研究主要集中在其蛋白酶抑制劑活性上。TFPI2結(jié)構(gòu)中包含3個串聯(lián)重復Kunitz-type蛋白酶抑制域[14]。由于能廣泛抑制絲氨酸蛋白酶（包括纖溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶），TFPI2可以在調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。通過廣泛抑制蛋白酶，TFPI2可以保護細胞外基質(zhì)免受降解，從而抵抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，TFPI2過表達可以抑制肺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞生長和侵襲。TFPI2還被發(fā)現(xiàn)可以誘導凋亡，抑制血管新生。因此，TFPI2被認為是一個抑癌因子。后來有研究發(fā)現(xiàn)，TFPI2在鱗癌細胞及組織中專一性過表達，與其他類型的卵巢癌相比，卵巢鱗癌在Ⅰ期的診治率很高[15]。本研究舌鱗癌組織中的TFPI2也同樣是表達上調(diào)，對病人的預后產(chǎn)生影響。

SDS具有將絲氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的作用，廣泛分布于細菌、真菌、動植物的器官中[16]。參與氨基酸代謝的酶一般有兩種或多種異構(gòu)體，而其中一種異構(gòu)體會在腫瘤細胞中表達。雖然cSDS基因在腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄表達，很少翻譯為蛋白，但是其在腫瘤細胞中的表達仍有很重要的生理意義[17]。

ANLN是編碼蛋白基因，在大腦、胎盤、睪丸中的表達水平較高，在心臟、腎臟、肝臟、肺臟、胰腺、前列腺、脾臟中的表達水平較低[18]。研究結(jié)果表明，ANLN在多種腫瘤中呈高表達，如乳癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌等[19]。ANLN高表達是結(jié)直腸癌、胃癌、乳癌、頭頸癌預后不良的因素[20]。

本研究采用生物信息學的方法分析了舌鱗癌DEGs的相關(guān)數(shù)據(jù)，篩選了其相關(guān)的MF和信號通路，使我們更深入地了解了舌鱗癌潛在分子發(fā)生發(fā)展機制，并為進一步的實驗研究提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯?馬偉平）