廖世杰 李波香 馮文宇 劉云 羅愷 丁曉飛 趙勁民

[ 摘要] 目的 研究中藥單體鷹嘴豆芽素 A?對(duì)Perthes 病股骨頭畸形、對(duì)破骨細(xì)胞分化以及破骨細(xì)胞功能的影響，以找尋治療和預(yù)防該病的藥物。方法 建立股骨頭缺血性壞死動(dòng)物模型，鷹嘴豆芽素 A?干預(yù)后觀察股骨頭形態(tài)學(xué)改變。不同濃度鷹嘴豆芽素A 干預(yù) RANKL?誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，TRAP?染色后觀察破骨細(xì)胞數(shù)量改變，RT-PCR?檢測(cè) TRAP、MMP-9?水平。結(jié)果 鷹嘴豆芽素 A?可以緩解股骨頭缺血性壞死后畸形，抑制破骨細(xì)胞的形成以及標(biāo)志基因 TRAP、MMP-9?表達(dá)。結(jié)論 鷹嘴豆芽素 A 可以預(yù)防股骨頭缺血性壞死，是可預(yù)防股骨頭缺血性壞死后畸形的潛在藥物。

關(guān)鍵詞：鷹嘴豆芽素 A;兒童股骨頭缺血性壞死;破骨細(xì)胞;中藥單體

【中圖分類(lèi)號(hào)】R816.8 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2019）05-010-03

股骨頭缺血性壞死（ischemic osteonecrosis of the femoral head ，ONFH）可發(fā)生于成人或兒童中，是由各種原因造成股骨頭缺血后發(fā)生的髖部疾患。Legg-Calvé-Perthes disease，簡(jiǎn)稱(chēng) Perthes 病，是發(fā)生于兒童的特發(fā)性股骨頭缺血性壞死 [1]。

股骨頭骨骺缺血壞死愈合后可遺留不同程度畸形，嚴(yán)重影響兒童的身心健康，是青年髖關(guān)節(jié)置換的主要原因之一 [2] 。

股骨頭缺血壞死后破骨細(xì)胞異常激活和隨之而來(lái)的局部骨溶解是股骨頭骨骺畸形愈合的重要原因 [3-5]。骨髓來(lái)源的造血祖細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的刺激下向壞死區(qū)遷移形成破骨細(xì)胞，執(zhí)行骨吸收功能。鷹嘴豆芽素 A?主要來(lái)源于鷹嘴豆芽素豆、紅車(chē)軸草全草，屬于黃酮類(lèi)天然化合物。鷹嘴豆芽素有許多藥理特性，如：抗氧化、抗炎及抗腫瘤等 [6]。既往研究表明，鷹嘴豆芽素 A?可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的活化來(lái)改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。但兒童股骨頭缺血性壞死破骨細(xì)胞分化的機(jī)制與骨質(zhì)疏松癥不完全相同，本研究通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探究鷹嘴豆芽素A?對(duì)Perthes?病股骨頭骨骺畸形愈合的預(yù)防作用。 ??????????? ??????????????????????????????????????????????????1?材料與方法

1.1?動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)使用雄性 Sprague-Dawley?大鼠（8?周齡，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，中國(guó)）。大鼠在 SPF?級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，可自由活動(dòng)、獲取食物和水。鷹嘴豆芽素 A（純度> 99% ， 購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司）， 溶于二甲基亞砜（Aladdin?試劑公司）。培養(yǎng)基 α-MEM?和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于 Gibco BRL。重組可溶性巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和重組小鼠可溶性 RANKL 購(gòu)于美國(guó)R&D公司。CCK-8 購(gòu)自Beyotime生物技術(shù)研究所。 TRAP染色試劑盒購(gòu)于Sigma-Aldrich。其他化學(xué)品購(gòu)自 Sigma 公司。

1.2?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

該實(shí)驗(yàn)得到廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。 12?只大鼠隨機(jī)分為 4?組：假手術(shù)組（Sham，n?= 6），骨壞死組（ON， n?= 6），鷹嘴豆芽素 A?治療的骨壞死組（ON?+ 鷹嘴豆芽素 A，n?= 6）。動(dòng)物模型的建立，采用經(jīng)典的股骨頸環(huán)扎法 [7，8]。簡(jiǎn)而言之，在麻醉后，在右側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子上方的皮膚上縱向切開(kāi)皮膚，分離臀大肌和臀中肌以暴露關(guān)節(jié)囊。打開(kāi)關(guān)節(jié)囊，用不可吸收線結(jié)扎股骨頸（# 3-0 Vicryl， Ethicon）。股骨頭復(fù)位后，逐層縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組僅解剖關(guān)節(jié)囊，不結(jié)扎股骨頸。手術(shù)后，鷹嘴豆芽素 A

組隔天腹腔注射鷹嘴豆芽素 A（ 5 mg / kg），持續(xù) 4 周。假手術(shù)組和骨壞死組予相同劑量的 PBS。術(shù)后 4 周對(duì)所有動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。造模側(cè)股骨頭取材后用拍照觀察。

1.3?骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMMs）提取 ????????????????????????????????4?周齡大的 C57BL?小鼠用于提取造血祖細(xì)胞。對(duì)小鼠

實(shí)行安樂(lè)死后，分離出小鼠股骨和脛骨，剪刀剪去兩端骨骺后，使用裝滿完全培養(yǎng)基的注射器將骨髓細(xì)胞從骨髓腔內(nèi)沖出，即為骨髓造血祖細(xì)胞。 隨后將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移至

T75 培養(yǎng)瓶中，并加入含有 MCSF（30ng/mL）、10% FBS 的 α-MEM 的培養(yǎng)液，細(xì)胞在 37℃的 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) （ 下同 ）。即可得到 BMMs。

1.4?破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

將 BMMs 從 T75 中消化下來(lái)后， 按 6×103 / 孔的密度轉(zhuǎn)移到 96 孔板中，使用完全培養(yǎng)基（含有 MCSF30 ng/ mL、RANKL 100 ng/mL 和 10% FBS 的 α-MEM 的培養(yǎng)液 ， 下同） 進(jìn)行培養(yǎng)。 按鷹嘴豆芽素 A 濃度（0，2.5，5，10 和20μM）進(jìn)行分組，并設(shè)置不加 RANKL 的陰性對(duì)照組。按上述培養(yǎng)條件孵育細(xì)胞，隔天換液至 7 天，顯微鏡下觀

察出現(xiàn) 3 個(gè)核及以上巨噬細(xì)胞即判斷為破骨細(xì)胞。此時(shí)用PBS 清洗培養(yǎng)液并用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞。避光條件下使用TRAP 染色試劑盒染色15 分鐘。隨后下顯微鏡下拍照， 超過(guò)三個(gè)細(xì)胞核并且 TRAP 染色陽(yáng)性即為破骨細(xì)胞，記錄其數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)。

1.5?細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

使用 CCK-8 試劑盒來(lái)檢測(cè)不同濃度鷹嘴豆芽素 A 對(duì)BMMs 的細(xì)胞毒性作用。 按 6×103 細(xì)胞密度，使用完全α-MEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞種于 96 孔板中，按鷹嘴豆芽素濃度分組（0，2.5，5.0，10，20 和 40μM），每個(gè)分組有 3 個(gè)副孔。培養(yǎng) 48 小時(shí)后，按 CCK8 說(shuō)明書(shū)要求，向每個(gè)孔中加入 10μL CCK-8 緩沖液，按要求培養(yǎng) 4 小時(shí)。 使用吸光度酶標(biāo)儀（Infinite M1000 PRO，Tecan）在 450nm 下測(cè)量每個(gè)孔的吸光度。

1.6?聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）

將上述 BMMs 按 1. 2×105 個(gè)細(xì)胞 / 每孔種入 6 孔板中， 用含 30 ng /mL M CSF 和 100 ng /mL RANKL 的培養(yǎng)液培養(yǎng)，并用鷹嘴豆芽素 A（0，5，10 和 20μM） 干預(yù)。上述條件培養(yǎng)細(xì)胞，每 48 小時(shí)換液至第 5 天。當(dāng)顯微鏡下觀察到鷹嘴豆芽素 （ 0μM） 出現(xiàn)大而融合的破骨細(xì)胞時(shí)，即用Trizol 將細(xì)胞裂解，按相關(guān)操作說(shuō)明提取總 RNA，再將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。然后，使用 Real - Time PCR 儀器檢測(cè) ACP5 （ TRAP ）、MMP9 基因的擴(kuò)增情況。序列。

1.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。 用獨(dú)立樣本

t 檢驗(yàn)（對(duì)于兩組）或單向 ANOVA（對(duì)于兩組以上）分析數(shù)據(jù)。通過(guò)Pearson 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行參數(shù)間的相關(guān)分析。假設(shè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性為 P < 0.05。 星號(hào)（*，** 和 ***）分別代表 P < 0.05，P < 0.01 和 P < 0.001。

2.1?鷹嘴豆芽素 A?可改善股骨頭缺血性壞死后股骨頭

畸形

股骨頭骨骺血供中斷是 Perthes 病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，我們采用經(jīng)典的股骨頸環(huán)扎法建立動(dòng)物模型。建模后 4 周， 與假手術(shù)組大鼠相比，骨壞死組大鼠股骨頭外觀呈明顯扁平狀畸形，股骨頭骨骺出現(xiàn)骨壞死（圖 1 A，B）。結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。與假手術(shù)組比較，鷹嘴豆芽素 A 治療組股骨頭骨骺稍扁平，但是畸形程度較缺血性骨壞死組大鼠輕（圖 1 A，B 和 C）。大體觀結(jié)果初步提示鷹嘴豆芽素

A 可改善股骨頭缺血性壞死后畸形。

2.2?鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細(xì)胞分化

目前研究表明，破骨細(xì)胞過(guò)度活化促進(jìn)了股骨頭壞死后畸形愈合，因此我們進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)：觀察鷹嘴豆芽素 A 對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。如圖 2-A?所示，陰性對(duì)照組中未看到 TRAP?陽(yáng)性破骨細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照組中清楚地觀察到大量 TRAP?陽(yáng)性破骨細(xì)胞，不同濃度的鷹嘴豆芽素 A?處理后破骨細(xì)胞的數(shù)量有明顯差異（圖 2-B）。我們對(duì)各個(gè)分組進(jìn)行破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，20μM?組破骨細(xì)胞數(shù)為98.68±6.642 /?孔，顯著低于10.00μM?組（147±4.509 /?孔）、

5.00μM?組（172±9.074 /?孔）、2.5μM?組（265±5.508/?孔） 和對(duì)照組（271.3±11.22/ 孔）（圖 2-A）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明， 組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 2?B）。因此，鷹嘴豆芽素

A 可抑制 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，抑制程度與藥物濃度呈正相關(guān)。

2.3?鷹嘴豆芽素 A 對(duì)破骨細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性

為了排除是否鷹嘴豆芽素 A 對(duì)破骨細(xì)胞細(xì)胞毒性導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量減低，我們進(jìn)行了 CCK-8 試驗(yàn)。結(jié)果表明， 高濃度的藥物有顯著細(xì)胞毒性，但本研究中， 鷹嘴豆芽素

A?刺激 BMMs?48 小時(shí)后，使用的藥物濃度（0，2.5，5.0，10，

20?和 40μM）對(duì) BMMs?活性沒(méi)有顯著的細(xì)胞毒性作（圖 2

C）。 這些結(jié)果表明，鷹嘴豆芽素抑制破骨細(xì)胞分化時(shí)沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。

2.4?鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄

破骨細(xì)胞分化過(guò)程中可表達(dá)一些標(biāo)志性基因，例如MMP-9， TRAP。TRAP?是破骨細(xì)胞分化的特異性基因，而MMP-9?在骨吸收是發(fā)揮重要作用。在該實(shí)驗(yàn)中，將 BMMs 分成 3?組：對(duì)照組，用 RANKL?誘導(dǎo)的 BMMs?和用 RANKL 誘導(dǎo)并用鷹嘴豆芽素A?處理的BMMs。鷹嘴豆芽素 A（5，10 和20μM）可以抑制RANKL?誘導(dǎo)的MMP-9，TRAP?的轉(zhuǎn)錄， 與對(duì)照組（鷹嘴豆芽素 A 0μM）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

骨壞死區(qū)破骨細(xì)胞過(guò)度活化及造成的骨溶解，是

Perthes 病股骨頭骨骺畸形愈合的主要原因。因此，抑制破骨細(xì)胞分化可作為預(yù)防股骨頭股骨頭骨骺畸形愈合的潛在非手術(shù)方法。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，鷹嘴豆芽素 A 治療組可改善股骨頭缺血性壞死后畸形。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鷹嘴豆芽素 A 可在無(wú)細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)抑制破骨細(xì)胞分化，可抑制破骨細(xì)胞分化特異性基因 TRAP 和MMP9 轉(zhuǎn)錄。因此，鷹嘴豆芽素 A 可作為改善股骨頭缺血性壞死后畸形的潛在天然活性藥物。

股骨頭缺血性壞死后病理改變促進(jìn)了破骨細(xì)胞分化， 這些因素包括壞死物質(zhì)持續(xù)存在 [3，5]，髖關(guān)節(jié)滑膜液中

IL-6、IL-17?顯著升高 [4]。這些條件共同構(gòu)成了持續(xù)的骨壞死區(qū)慢性炎性改變。該環(huán)境下細(xì)胞因子可通過(guò)直接或間接途徑刺激 RANK、RANKL?表達(dá)而使得破骨細(xì)胞持續(xù)過(guò)度激活 [9]。其結(jié)果是造成股骨頭骨小梁過(guò)度吸收、力學(xué)強(qiáng)度下降和股骨頭骨骺塌陷，最終形成股骨頭扁平狀畸形 [10]。因此，抑制破骨細(xì)胞分化理論上可預(yù)防股骨頭骨骺畸形。

Kim?等 [11，12]?研究發(fā)現(xiàn)抑制 IL-6 表達(dá)或者競(jìng)爭(zhēng)性拮抗 IL-6 受體都可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞分化緩解股骨頭畸形。直接使用 RANKL?受體單抗，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明具有治療 Perthes 病的效果 [13]。鷹嘴豆芽素 A 作為黃酮類(lèi)化合物，可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的分化而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的骨量丟失。但其在股骨頭缺血性壞死中的作用也未得到研究。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，股骨頭壞死組股骨頭呈扁平狀畸形，有明顯的骨壞死。盡管較假手術(shù)組仍有畸形，但使用鷹嘴豆芽素 A?治療后，畸形程度可得到緩解。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)表明，在破骨細(xì)胞分化期間不同濃度的鷹嘴豆芽素 A?可降低

TRAP 染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞形成。而且這種效果呈濃度是呈濃度依賴(lài)的，CCK-8 實(shí)驗(yàn)表明該藥物濃度下沒(méi)有細(xì)胞毒性。該結(jié)果和以往的研究結(jié)果類(lèi)似。

破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，RANKL 與其受體 RANK 結(jié)合后，可激活下游一系列信號(hào)通路，包括 MAPK 信號(hào)通路、NF-κB[14，15]。這些信號(hào)通路在破骨細(xì)胞分化的作用不同， 但是均可促進(jìn) c-FOS，NFATc1 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞內(nèi)特異性基因的表達(dá)，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯而發(fā)揮功能 [16]。TRAP 是破骨細(xì)胞分化中最特異性基因，其表達(dá)抗酒石酸酸性磷酸酶，該蛋白是破骨細(xì)胞分化的特異性蛋白。MMP-9 即金屬基質(zhì)蛋白酶 9，其屬于金屬基質(zhì)蛋白酶家族， 其在骨吸收中的作用是講解細(xì)胞外基質(zhì) [17]。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，在抑制破骨細(xì)胞分化的濃度范圍內(nèi)，鷹嘴豆芽素

A 可抑制 TRAP、MMP-9 的表達(dá)，該結(jié)果進(jìn)一步解釋了鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制。

鷹嘴豆芽素 A 可改善股骨頭缺血性壞死后畸形，其可能的機(jī)制是抑制破骨細(xì)胞分化。因此，鷹嘴豆芽素 A 可作為一種潛在的藥物用于改善股骨頭缺血性壞死后畸形。

• Kuroyanagi G， Adapala NS， Yamaguchi R， et al. Interleukin-6 deletion stimulates revascularization and new bone formation following ischemic osteonecrosis in a murine model[J]. Bone， 2018， 116： 221-231.

1946-1954.

[ 基 金 項(xiàng) 目 ] ?廣 西 研 究 生 教 育 創(chuàng) 新 計(jì) 劃 項(xiàng) 目

（YCBZ2018035）， 廣 西 自 然 基 金 青 年 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目

（2018GXNSFBA281090）， 廣 西 醫(yī) 科 大 學(xué) 大 學(xué) 生 創(chuàng) 新課 題（201910598259）， 廣 西 自 然 科 學(xué) 基 金 面 上 項(xiàng) 目（2017GXNSFAA198305）

[ 作者簡(jiǎn)介] 廖世杰（1985-），男，廣西梧州人，在讀博士，?主治醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科、手外科及小兒骨科工作。

[ 通訊作者 ] 趙勁民，E-mail： zhaojinmin@126.com