陶興魁 高貴珍 張興桃

摘要：目的：為了篩選藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基，借助藍(lán)莓試管苗無(wú)性繁殖的優(yōu)點(diǎn)使其快速繁殖.方法：利用藍(lán)莓葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的生成，選擇不同種類(lèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及不同濃度組合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)以找出最適宜藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基.結(jié)果和結(jié)論：WPM1/2基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，NAA對(duì)藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織影響最大，藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為WPM1/2+0.5mg·L-1 ZT+1.0mg·L-1 IAA+0.15mg·L-1 NAA.

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓葉片;愈傷組織;正交試驗(yàn);培養(yǎng)基

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2019）06-0032-04

藍(lán)莓（blueberry）又被稱為越橘或藍(lán)漿果，藍(lán)莓是“漿果之王”，它的果皮相對(duì)較薄，有著自己獨(dú)特的風(fēng)味以及豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，味道酸甜[1].藍(lán)莓的果實(shí)中存在較多的營(yíng)養(yǎng)組分，被國(guó)際糧農(nóng)組織列為五大健康食品之一[2-3].藍(lán)莓被譽(yù)為“黃金漿果”在我國(guó)具有很好的市場(chǎng)發(fā)展前景[4-5].藍(lán)莓常規(guī)繁殖速度較慢，且病毒感染嚴(yán)重，品種容易退化[6-7]，利用組織培養(yǎng)則繁殖速度較快，且能保持品種特性[8].國(guó)內(nèi)外對(duì)于藍(lán)莓組培研究，多集中對(duì)藍(lán)莓莖段或芽、莖尖等外植體誘導(dǎo)植株再生的研究[9-12]，但是較少的研究涉及以藍(lán)莓葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的研究.在本實(shí)驗(yàn)中，采用藍(lán)莓的葉片作為外植體，在試驗(yàn)中采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)MS培養(yǎng)基、改良MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、WPM1/2培養(yǎng)基、1/2WPM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選.然后利用ZT、NAA、IA三種激素之間的不同濃度組合來(lái)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，研究藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)的愈傷組織的最適培養(yǎng)條件.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

苗圃園藍(lán)莓幼嫩葉片.

1.1.2 試劑材料

IAA、NAA、ZT、瓊脂、蔗糖、消毒劑等.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所及儀器

組培室、無(wú)菌操作臺(tái)、紫外燈、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、稱量紙、皮筋、封口膜、三角燒瓶（500ml）、量筒（500ml、1000ml）、燒杯（500ml、1000ml）、長(zhǎng)鑷子、記號(hào)筆、培養(yǎng)皿、酒精燈、恒溫水浴鍋、玻璃棒等.

1.2 方法

1.2.1 外植體的選擇和滅菌

幼嫩葉片，用清水浸泡，溫度控制在20℃～25℃，用自來(lái)水沖洗3h，剪取1.0～1.5cm見(jiàn)方的塊，用清水反復(fù)沖洗，然后在超凈工作臺(tái)上用75%酒精溶液處理30s，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用1%升汞溶液浸泡5min，用無(wú)菌水沖洗5～6次，沖洗速度先快后慢.

1.2.2 培養(yǎng)基的篩選

分別以MS培養(yǎng)基、改良的MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、1/2WPM培養(yǎng)基（WPM中大量元素減半）、WPM1/2培養(yǎng)基（WPM中各組分減半）為基本培養(yǎng)基，添加1.0mg·L-1IAA，0.5mg·L-1ZT篩選適合葉片誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基.

1.2.3 葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

以正交實(shí)驗(yàn)因素水平表為依據(jù)，采用L9（33）正交表配制9種培養(yǎng)基，葉片剪成1.0～1.5厘米見(jiàn)方的塊，在無(wú)菌條件下接種于培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶種4～5個(gè)，重復(fù)3次，經(jīng)過(guò)30d培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)出愈率，觀察愈傷組織的長(zhǎng)勢(shì).

1.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)定指標(biāo)

出愈率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體的總數(shù)×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

2.1.1 結(jié)果

將適量處理好的葉片接種到MS、改良的MS、WPM、1/2WPM、WPM1/2五種培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，部分葉片出現(xiàn)卷曲、邊緣開(kāi)始出現(xiàn)一些白色的小顆粒，愈傷組織開(kāi)始生成（圖1-2），30d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果并記錄.

通過(guò)對(duì)表3的分析可知，培養(yǎng)基有利于藍(lán)莓葉片愈傷組織的程度由大到小的順序是WPM1/2>改良MS>WPM>1/2WPM>MS，這表明WPM1/2最適宜葉片誘導(dǎo)愈傷組織的生成.

2.2 不同濃度配比的植物生長(zhǎng)劑對(duì)藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

2.2.1 結(jié)果

在WPM1/2基本培養(yǎng)基中加入不同濃度的ZT、NAA、IAA植物生長(zhǎng)劑，在接種20d后同樣也會(huì)發(fā)生葉片邊沿卷起，葉片邊緣開(kāi)始出現(xiàn)少量白色的小顆粒（圖3-6），30d后統(tǒng)計(jì)出愈率.

通過(guò)對(duì)表4的極差分析，極差R值越大表示該因素的影響也較大，所以對(duì)藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響大小為NAA>IAA>ZT，這說(shuō)明NAA對(duì)于出愈率的影響最大.可以看出當(dāng)NAA濃度增大時(shí)，出愈率也會(huì)隨之增加.表中K值越大說(shuō)明這個(gè)水平較高，由表4可以得出，ZT的均值K1>K2>K3，IAA的均值K2>K3>K1，NAA的均值K3>K2>K1，正交實(shí)驗(yàn)是較為均一的實(shí)驗(yàn)，只是全部實(shí)驗(yàn)中一部分，所以在表中未被表現(xiàn)出來(lái)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析說(shuō)明最優(yōu)的處理組合為A1B2C3.同時(shí)通過(guò)圖3、圖4、圖5、圖6看出，藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)的愈傷組織在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)由淺綠色變褐色的現(xiàn)象，并且愈傷組織的疏松程度也不同，有的葉片生成的愈傷組織較密，然而有的葉片生成的愈傷組織較為疏松.

正交試驗(yàn)是一種均一性設(shè)計(jì)試驗(yàn)，不可能包含全部處理組合，因此A1B2C3在實(shí)驗(yàn)中就沒(méi)有顯現(xiàn)出來(lái).為驗(yàn)證A1B2C3是最優(yōu)組合，配制此種培養(yǎng)基20瓶進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).表5表明，AA1B2C3組合愈傷組織出愈率達(dá)到93.3%，明顯高于正交表中的9種培養(yǎng)基，進(jìn)一步對(duì)比分析圖片（圖7、圖8）可以發(fā)現(xiàn)，兩張圖片中的愈傷組織顏色不相同，圖7中的葉片為綠色，并且較為疏松，而圖8中的愈傷組織為淺黃色，并且較為密集，長(zhǎng)勢(shì)明顯較好.這說(shuō)明A1B2C3組合的培養(yǎng)基確實(shí)比5號(hào)培養(yǎng)基更適合藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)，這也就是證實(shí)了藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適的處理實(shí)驗(yàn)組合為WPM1/2+0.5 mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.15mg·L-1NAA.

為了能夠更準(zhǔn)確分析植物生長(zhǎng)劑對(duì)藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響，因此也進(jìn)行了方差分析，結(jié)果表明NAA具有顯著性，說(shuō)明NAA對(duì)于藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響最大，此結(jié)果和極差分析中的結(jié)果相符.

3 結(jié)論和討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究表明藍(lán)莓組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基、改良MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、WPM1/2培養(yǎng)基、1/2WPM培養(yǎng)基均能使藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出WPM1/2培養(yǎng)基的效果最好.實(shí)驗(yàn)采用NAA生長(zhǎng)素、IAA生長(zhǎng)素、ZT分裂素之間的組合，結(jié)果得到NAA對(duì)于藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織影響最大，并且隨著NAA濃度的增大，出愈率也隨之增大.對(duì)于藍(lán)莓葉片誘導(dǎo)的愈傷組織的適合培養(yǎng)條件為WPM1/2+0.5mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.15mg·L-1NAA.在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓愈傷組織在未接種到分化培養(yǎng)基之前，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的生長(zhǎng)后會(huì)出現(xiàn)不同的變化，即有的愈傷組織由綠色變?yōu)楹稚?，有的愈傷組織由白色變?yōu)榈S色，且愈傷組織較為密集.

本實(shí)驗(yàn)中也存在一些的不足，一方面在實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)一定的葉片污染，因此在以后的實(shí)驗(yàn)中要更加注意實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的滅菌;另一方面，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓愈傷組織出現(xiàn)了不同程度的褐化現(xiàn)象，可能是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度或者彼此之間濃度配比不同所導(dǎo)致，這些問(wèn)題在以后的實(shí)驗(yàn)中有待進(jìn)一步研究.

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