胡曉苗 潘孝成 張丹俊 趙瑞宏 戴銀 潘孝成 侯宏艷 沈?qū)W懷 尹磊

摘要 [目的]對(duì)六安、郭河、宣城、肥西某養(yǎng)殖戶送檢的疑似腺病毒的病料進(jìn)行分離鑒定，為進(jìn)一步鑒別、預(yù)防和控制疾病提供科學(xué)的理論依據(jù)。[方法]首先采集病例中雞的肝臟，提取病毒DNA，根據(jù)Genbank已登錄腺病毒的hexon基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR檢測(cè)病料中腺病毒，對(duì)擴(kuò)增的序列進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆子篩選，并對(duì)擴(kuò)增到的序列進(jìn)行測(cè)序鑒定，最后將獲得的基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹分析確定安徽省部分地區(qū)禽腺病毒血清型。[結(jié)果]臨床中疑似腺病毒感染的主要癥狀為心包積液和肝臟腫大，用設(shè)計(jì)的引物均檢測(cè)出大小為599 bp的目的基因條帶，序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此次檢測(cè)的腺病毒均為4型腺病毒。[結(jié)論]試驗(yàn)建立了快速檢測(cè)禽腺病毒的方法，為安徽省地區(qū)禽腺病毒防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 禽腺病毒;hexon;測(cè)序;血清型鑒定

中圖分類號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-3305（2019）06-018-03

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.06.008

Identification and Analysis of Four Avian Adenovirus Strains

HU Xiao-miaoet al（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective] The suspected adenovirus samples from a farmer in Lu’an， Guohe， Xuancheng and Feixi were isolated and identified， which provided a scientific theoretical basis for further identification， prevention and control of diseases. [Method] Firstly， the chicken liver was collected， the virus DNA was extracted， and the primers were designed according to the hexon gene of the adenovirus that GenBank had registered. The adenovirus was detected by PCR， the amplified sequence was transformed and the positive clone was screened， and the amplified sequence was sequenced and identified. Finally， the obtained gene sequence was constructed and analyzed by evolutionary tree to determine the fowl adenovirus serotype in Anhui Province.[Result] In clinical practice， the main symptoms of adenovirus infection were pericardial effusion and liver enlargement. The designed primers were used to detect the target gene band with a size of 599 bp. Sequence comparison results showed that all the tested adenoviruses were type 4 adenoviruses.[Conclusion] The method of rapid detection of avian adenovirus was established， which provided a theoretical basis for the prevention and control of avian adenovirus in Anhui Province.

Key words Avian adenovirus;hexon;Sequencing;Serotype identification

Identification and Analysis of Four Avian Adenovirus Strains

HU Xiao-miaoet al（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective] The suspected adenovirus samples from a farmer in Lu’an， Guohe， Xuancheng and Feixi were isolated and identified， which provided a scientific theoretical basis for further identification， prevention and control of diseases. [Method] Firstly， the chicken liver was collected， the virus DNA was extracted， and the primers were designed according to the hexon gene of the adenovirus that GenBank had registered. The adenovirus was detected by PCR， the amplified sequence was transformed and the positive clone was screened， and the amplified sequence was sequenced and identified. Finally， the obtained gene sequence was constructed and analyzed by evolutionary tree to determine the fowl adenovirus serotype in Anhui Province.[Result] In clinical practice， the main symptoms of adenovirus infection were pericardial effusion and liver enlargement. The designed primers were used to detect the target gene band with a size of 599 bp. Sequence comparison results showed that all the tested adenoviruses were type 4 adenoviruses.[Conclusion] The method of rapid detection of avian adenovirus was established， which provided a theoretical basis for the prevention and control of avian adenovirus in Anhui Province.

Key words Avian adenovirus;hexon;Sequencing;Serotype identification

禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，主要寄生于禽類的眼、上呼吸道、肝、腎、生殖道和消化道內(nèi)，但以隱性或不顯性感染為主，一旦機(jī)體受到應(yīng)激反應(yīng)或其他疾病感染時(shí)，病毒就會(huì)很快發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生致病性，同時(shí)也可以作為原發(fā)性病原引起其他疾病的繼發(fā)感染。禽腺病毒有A～E 5個(gè)亞群，根據(jù)交叉中和試驗(yàn)分為12個(gè)血清型，為FAV1～FAV12。查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，12種血清型在致病性上都有各自的特征，而且同一血清型中的不同毒株也會(huì)有不同的致病性表現(xiàn)。Ⅰ群禽腺病毒的毒粒共有250個(gè)顆粒，其中結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體（hexon）含有240個(gè)殼粒，由此可見hexon占了90%以上，因而依據(jù)編碼該基因蛋白建立的PCR分子診斷方法可更準(zhǔn)確地對(duì)該群血清型進(jìn)行鑒定。病毒的傳播擴(kuò)散主要經(jīng)過(guò)雞胚進(jìn)行垂直傳播，同時(shí)也經(jīng)過(guò)水平傳播擴(kuò)散，該病毒擴(kuò)散能力較強(qiáng)，潛伏期短，發(fā)病快，正常雞接觸后極易發(fā)生感染。

2019年3—5月，筆者于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所收集了4份疑似禽腺病毒感染家禽的肝臟作為病毒分離材料，根據(jù)Genbank已登錄腺病毒的hexon基因設(shè)計(jì)引物，尋找最佳的PCR反應(yīng)體系檢測(cè)病料中腺病毒的有無(wú)，對(duì)擴(kuò)增的序列進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆子篩選并把擴(kuò)增到的序列送至生物公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，最后將獲得的基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹確定安徽省部分地區(qū)禽腺病毒血清型。經(jīng)檢測(cè)4份病料均為陽(yáng)性病料，與血清4型同源性最高，這為準(zhǔn)確和快速對(duì)禽腺病毒進(jìn)行檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)疑似FAV病料的鑒定及測(cè)序分析，進(jìn)一步了解到Ⅰ群禽腺病毒的感染流行病學(xué)特點(diǎn)，為其防治提供了科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

4份病料分別來(lái)源于六安某養(yǎng)殖戶送檢的18日齡土雞、郭河某養(yǎng)殖戶送檢的40日齡土雞、宣城某養(yǎng)殖戶送檢的20日齡白羽肉雞和肥西某養(yǎng)殖戶送檢的2月齡土雞。

1.2 臨床病理檢查

雞群感染后通常表現(xiàn)為食欲減退、萎靡不振、羽毛蓬亂，發(fā)病前無(wú)明顯的特殊行為表現(xiàn)，通常發(fā)病快、死亡快。禽腺病毒C種血清4型感染的病例臨床剖檢可見心包有淡黃色積液，肝臟腫大、顏色變淡有炎癥、表面有出血點(diǎn)等病理變化。

1.3 病毒hexon基因的PCR擴(kuò)增和鑒定

1.3.1 病毒基因組DNA的提取 病毒DNA的提取參照提取試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.2 病毒引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank公司已登錄的禽腺病毒序列設(shè)計(jì)此次試驗(yàn)引物基因hexon的序列（5’3’）：上游引物為CCAAGATGGCGCACGCAACTACAA，下游引物為AGCGCGAAAGGCGTACGGAAG，預(yù)期PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為599 bp。用設(shè)計(jì)的引物尋找PCR擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系和程序，然后對(duì)4份分離的毒株進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.3.3 基因的PCR擴(kuò)增 以提取的DNA作為模板，進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μl：Taq mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，滅菌蒸餾水補(bǔ)至25 μl，在無(wú)菌超凈臺(tái)中將上述液體加到0.5 ml EP管中，EP管事先經(jīng)過(guò)高壓鍋消毒滅菌。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.3.4 擴(kuò)增基因與T載體的連接轉(zhuǎn)化PCR擴(kuò)增獲得的目的條帶片段進(jìn)行回收，參照瓊脂糖DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，然后進(jìn)行T載體連接與轉(zhuǎn)化。①將回收的DNA片段與pMD18T Vector連接，連接體系如下：T載體（pMD18T Vector）0.5 μl，目的基因（hexon）4.5 μl，Solution Ⅰ 5.0 μl。將連接好的體系置于16℃水浴30 min。②轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用搖后的菌液進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如上所示。最后將能成功PCR檢測(cè)出擴(kuò)增目的基因的菌液送去測(cè)序。測(cè)序工作由南京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.3.5 陽(yáng)性克隆子的篩選和序列測(cè)定 PCR擴(kuò)增到目的條帶的凝膠進(jìn)行回收，然后進(jìn)行T載體連接與轉(zhuǎn)化后，挑選出抗性板上長(zhǎng)出的菌落制成菌液，然后對(duì)PCR鑒定的陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序，對(duì)檢測(cè)得到的序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行拼接，經(jīng)過(guò)DNAstar軟件繪制出序列峰圖，觀察其各個(gè)主峰以及突變的位點(diǎn)，判斷其突變率是否在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。對(duì)擴(kuò)增得到的hexon基因部分序列，經(jīng)DNAstar軟件上下游查找后除去多余序列，之后得到的基因序列經(jīng)NCBI在線BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

1.4 擴(kuò)增序列的血清型鑒定

運(yùn)用DNAstar軟件系統(tǒng)將序列與各群hexon序列進(jìn)行同源性分析，根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)，比較hexon序列峰圖和同源性比對(duì)圖。然后根據(jù)生物公司檢測(cè)的序列結(jié)果經(jīng)MegAlign軟件繪制出遺傳系統(tǒng)的進(jìn)化樹，分析判斷4份毒株的血清型。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床病理的主要病理學(xué)變化

對(duì)4位養(yǎng)殖戶的陳述進(jìn)行記錄，病畜均有采食量減少、萎靡不振、蹲伏等表現(xiàn)，以及不同程度的死亡現(xiàn)象。對(duì)病死雞進(jìn)行整體觀察，發(fā)現(xiàn)有羽毛蓬亂、面部蒼白、營(yíng)養(yǎng)不良等表現(xiàn)。經(jīng)剖檢觀察，可見心包有淡黃色的積液，肝臟腫大、有出血點(diǎn)（圖1）。

2.2 目的基因的擴(kuò)增

對(duì)提取出的4份病料的DNA用設(shè)計(jì)的hexon引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，對(duì)成功PCR電泳跑出目的條帶的凝膠進(jìn)行回收，在T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞步驟后，挑選出抗性板上長(zhǎng)出的單個(gè)菌落制成菌液，然后對(duì)得到的菌液進(jìn)行PCR鑒定。由圖2可見，擴(kuò)增得到599 bp左右的片段，與預(yù)期大小相符。

2.3 陽(yáng)性克隆子的篩選

對(duì)成功PCR電泳的目的條帶的凝膠進(jìn)行回收，將成功完成陽(yáng)性克隆的基因送至生物公司測(cè)序，對(duì)檢測(cè)得到的序列圖經(jīng)過(guò)DNAstar軟件繪制出序列峰圖（圖3），可以觀察到各個(gè)主峰以及其突變的位點(diǎn)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)后經(jīng)比對(duì)其突變率均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。

對(duì)擴(kuò)增得到的hexon基因部分序列，經(jīng)DNAstar軟件上下游查找后除去多余序列，之后得到的基因序列經(jīng)NCBI在線BLAST分析并經(jīng)同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，4個(gè)病毒分離株的基因序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的FAV最為相近。分離株的hexon基因序列與血清4型FAV分離株NIVD2、SDSX1、SDTW/SD/TA/2015、HLJDAd15、SDTW116的同源性為99%（圖4）。

2.4 病毒hexon基因的進(jìn)化樹分析

根據(jù)生物公司檢測(cè)的序列結(jié)果經(jīng)MegAlign軟件繪制出遺傳系統(tǒng)的進(jìn)化樹。由圖5可見，該試驗(yàn)分離的4份病料的毒株與Ⅰ群腺病毒屬于同一分支，與血清4型的禽腺病毒親緣關(guān)系更近，核苷酸序列同源性為100%。

3 討論

3.1 hexon可以作為鑒定腺病毒的重要基因

臨床診斷是診斷動(dòng)物疫病最基本的方法，除了臨床診斷方法，也可用分子檢測(cè)對(duì)疾病進(jìn)一步確診。腺病毒的毒粒共有252個(gè)殼粒，其中240個(gè)六鄰體，12個(gè)五鄰體，五鄰體分布在每個(gè)角上，由此可見六鄰體蛋白（hexon）占據(jù)了病毒結(jié)構(gòu)的大部分。Hexon基因具有Ⅰ群禽腺病毒特異性抗原的決定簇，含有與細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)，可看作病毒的一種保護(hù)基因，用hexon基因作擴(kuò)增的引物可區(qū)分出A～E和不同的血清型，因此該試驗(yàn)選取hexon基因進(jìn)行克隆與序列分析，經(jīng)鑒定4份病料的分離株均與Ⅰ群禽腺病毒C種血清4型的同源性最高，親緣關(guān)系最近。

3.2 Ⅰ群禽腺病毒的現(xiàn)狀及防控

通過(guò)此次試驗(yàn)對(duì)FAVⅠ病料的分離鑒定分析和閱讀相關(guān)文獻(xiàn)后，了解到該病在雞群中的發(fā)病率近年來(lái)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且病毒擴(kuò)散能力較強(qiáng)，感染宿主的范圍也在逐漸擴(kuò)大，土雞、白羽肉雞、蛋雞、鵝、番鴨、麻鴨均出現(xiàn)對(duì)該病的感染病例。在大多數(shù)成年雞的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了腺病毒抗體的存在，由此可見禽腺病毒以隱性感染為主。因此在飼養(yǎng)過(guò)程中做好生物安全防控措施至關(guān)重要，同時(shí)做好常規(guī)疫苗免疫措施，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)水平，增強(qiáng)雞的免疫力，對(duì)于已出現(xiàn)感染病例的養(yǎng)殖場(chǎng)，應(yīng)做好相關(guān)隔離工作，控制疫病的大面積擴(kuò)散。

經(jīng)過(guò)查閱相關(guān)報(bào)道和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，在各地養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)的腺病毒感染病例主要表現(xiàn)為血清4型引起的心包積液綜合征、血清8型引起的包涵體肝炎和血清1型引起的砂囊糜爛。在12個(gè)血清型中其中1型病毒的纖突上有血凝素，剩下的血清型無(wú)此特性，在臨床病例的檢查中發(fā)現(xiàn)同一病例中可能存在2種以上的血清型病毒。同一個(gè)血清型中的不同毒株也會(huì)對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生不同的致病性，因此了解不同血清型的結(jié)構(gòu)及典型致病特點(diǎn)對(duì)該病的診斷防控有重要意義。

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責(zé)任編輯：鄭丹丹