楊熒 呂立堂 趙德剛

摘要：安吉白茶（Camellia sinensis 'Baiye1'）是典型的白化茶樹品種，為了對其葉片白化現(xiàn)象進行探究，本研究觀察了安吉白茶的白化葉和返綠葉的葉綠體超微結構，發(fā)現(xiàn)白化葉葉綠體內部結構發(fā)育不良，基粒片層排列疏松散亂，片層間縫隙大，層次不清晰，甚至斷裂不成形，根據對葉綠素及其前體物質含量的測定和對葉綠素合成的相關基因在兩個階段葉片中的表達量測定結果發(fā)現(xiàn)，Mg-proto Ⅸ在白化葉中含量要高于返綠葉，推測葉綠素合成階段的Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時受阻，確定安吉白茶發(fā)生白化是由于葉綠體發(fā)育不良，同時葉綠素合成階段的Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時受阻所致。

關鍵詞：安吉白茶;葉綠體;超微結構;葉綠素前體物

中圖分類號：S5711

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）06-0071-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.013

Comparison of Ultrastructure， Chlorophyll and Precursor Contents of Chloroplasts between Albino Leaves and Green Leaves in Camellia sinensis ‘Baiyel 1’

YANG Ying1，LV Li-tang2*，ZHAO De-gang1，3

（1.College of Tea / Research Institute of Agricultural Bioengineering， Guizhou University， key Laboratory of Germplasm Innovation for Conservation and Protection of Mountain Plant Resources， Guiyang， Guizhou 550025，China;2.Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang，Guizhou 550006，China）

Abstract：Camellia sinensis cv. Baiye1 is a typical albino tea cultivar. In order to investigate the albinism phenomenon of its leaves， the chloroplast ultrastructure of the albino leaves and the green leaves of Camellia sinensis cv. Baiye1 were observed， and it was found that the internal structure of the chloroplasts in the albino leaves was stunted. The grana lamellae were scattered and loosely arranged with big gaps， and the lamellar structure was not clear， even fractured. According to the determination of the content of chlorophyll and its precursors， and the expression of genes related to chlorophyll synthesis in leaves of two stages ， it was found that the content of Mg-proto IX in albino leaves was significantly higher than that in returning green leaves and speculated that the synthesis of Pchlide a from Mg-proto IX was blocked in the chlorophyll synthesis pathway. These results indicate that the albinism of Camellia sinensis cv. Baiye1 was due to chloroplast dysplasiaand the blocking synthesis of Pchlide a from Mg-proto IX.

Key words：Camellia sinensis cv. Baiyel; chloroplast; ultrastructure; chlorophyll precursor

茶湯中含有的茶多酚、氨基丁酸、脂多糖，微量元素錳、鋅、硒，茶坩寧等具保健作用，以茶樹白化突變體為原料制成的綠茶滋味鮮爽，香氣、外形、湯色、葉底等品質優(yōu)秀，提高了其經濟價值[1]，同時由于葉綠素含量降低，氨基酸含量明顯增高，使茶樹白化突變體制成的茶具有更高的營養(yǎng)價值[2]，植物的葉色突變與葉綠素的合成及葉綠體的發(fā)育息息相關[3-4]，安吉白茶（Camellia sinensis 'Baiye1'）作為典型的白化茶品種，經研究發(fā)現(xiàn)返白過程中氨基酸升高，葉綠素含量則下降[5]。本研究以安吉白茶為研究材料，對其白化葉和返綠葉葉綠體超微結構和葉綠素及其前體物含量進行比較和研究，以揭示安吉白茶白化的原因。

1材料與方法

11材料

安吉白茶（Camellia sinensis ‘Baiye1’）的白化葉及返綠葉作為研究材料，采樣于中國貴州六盤水市六枝特區(qū)黑曬村茶園（由四川引種），白化葉和返綠葉均處于相同的葉片發(fā)育階段，由本實驗室保存。

12試劑

植物RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit）、Premix TaqTM Version 20 plus dye、DL1000 DNA Marker5、Ehrlich-Hg試劑，三氯乙酸、乙酰丙酮、鹽酸、丙酮、正己烷、氨水、醋酸鈉、磷酸緩沖液試劑（NaH2PO4&Na2HPO4）、冰醋酸、乙醚、戊二醛等（若無說明均為國產或進口分析純）。

13主要儀器

分光光度計（BioPhotoMeter），PCR儀（Bio-rad），凝膠成像系統(tǒng)（XRS+），分析天平BS224S（Sartorius），電泳儀（Bio-rad），精密pH計pHS-2C（上海虹益），超純水儀（MicroPure），臺式離心機X1R（Thermo），超凈工作臺（上海上凈凈化），制冰機F100 Compact（Lcematic，高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750（SANYO），移液槍（Eppendorf）、分液漏斗、渦旋振蕩器SK-1（上海梅香）、數碼相機1000D（佳能）等。

14實驗方法

141電鏡觀察方法

為了確定安吉白茶白化過程中其葉綠體是否結構完整（存在或解體），對安吉白茶白化葉和返綠葉的細胞進行超微結構觀察，安吉白茶葉片樣本的制片和觀察方法均參照楊勇驥等人[6]的方法。

142葉綠素前體物質含量測定

為確定安吉白茶白化過程中是否存在葉綠素合成受阻現(xiàn)象，對葉綠素、類胡蘿卜素和葉綠素合成過程中主要的葉綠素前體物質的含量進行測定，其中δ-氨基乙酰丙酸（ALA）的測定參照Dei等人[7]的方法，膽色素原（PGB）的測定參照Bogorad等人[8]的方法，原卟啉IX protoporphyrin IX（ProtoIX：）、鎂原卟啉IX Mg-protoporphyrin IX（Mg- Proto IX）和原脫植基葉綠素（Pchlide）的相對含量測定參照Rebeiz和Lee等人[9-10]的方法。葉綠素和類胡蘿卜素的含量參照張治安等人[11]的方法。

143葉綠素合成相關基因表達量的測定

為對白化過程中葉綠素合成過程進行進一步的分析，將白化葉和返綠葉的葉綠素合成相關基因進行表達量的測定，參照Omega公司E.Z.N.A.Plant RNA Kits操作指南進行安吉白茶葉片RNA的提取。

cDNA合成參照TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV說明書進行，使用RTase M-MLV（RNase H-）反轉錄酶將提取的安吉白茶總RNA反轉錄為cDNA。

用Primer Premier 50軟件，根據定量PCR引物的設計原則，設計以下基因引物：白化轉綠基因gra（t），核糖核酸還原酶大亞基基因（RNRL1），谷氨酰-tRNA還原酶基因（HEMA1），鎂原卟啉原 IX 單甲酯環(huán)化酶基因（CRD1）設計各基因的RT-PCR擴增引物（表1）。以茶樹GAPDH、β-actin基因（actin）作為內參，定量分析相關基因的表達情況。參照ABI公司的操作指南，使用SYBR Green染料進行實時定量PCR分析，數據分析方法為ΔΔCT法。

144數據統(tǒng)計分析方法

采用Excel 2016和SPSS 23進行圖像繪制、統(tǒng)計分析、方差分析和多重比較，結果以x±s表示，文中圖表的表示方式均為平均值，文中所有數據均是3次重復試驗的平均值，所有圖也為3次重復試驗的平均值，誤差線表示3次重復試驗的標準偏差。

2結果和分析

21安吉白茶白化葉和返綠葉的葉色觀察

對安吉白茶白化階段的表型觀察，如圖1所示，安吉白茶白化性狀（圖1-b、c、d）基本出現(xiàn)在芽到芽下三到四葉（圖1中白化的芽、白化的幼葉和白化的成熟葉），白化性狀明顯（圖1-b、c、d），而完全成熟的老葉（圖1中芽下三、四葉以后的老葉）不會出現(xiàn)白化性狀（圖1- b、c、d）。

22安吉白茶白化葉和返綠葉葉綠體超微結構的觀察

將安吉白茶的白化葉和返綠葉樣本制片，觀察葉綠體的超微結構，發(fā)現(xiàn)在白化葉的細胞中葉綠體內部結構發(fā)育不良，基粒片層排列疏松散亂，片層間縫隙大，層次不清晰，甚至斷裂不成形（圖2-a、b）;返綠葉中的葉綠體結構良好，形狀多為長橢圓形或梭形，葉綠體被膜完整，片層結構垛疊整齊，基粒片層和基質片層均排列緊致且清晰（圖2-c、d）。從圖2可看出，安吉白茶的白化葉由于其葉綠體發(fā)育不良，使安吉白茶的葉色呈現(xiàn)出白化的性狀（圖1）。

23安吉白茶白化葉和返綠葉葉綠素及其前體物質含量的測定

為確定安吉白茶白化過程中葉綠素合成過程[12]受阻的具體階段，本試驗測定了安吉白茶的白化葉和返綠葉中主要的幾種葉綠素、類胡蘿卜素及葉綠素前體物質的含量，將白化葉和返綠葉的葉綠素及其前體物質的含量進行方差分析和多重比較（表2）。從表2可以看出，δ-氨基乙酰丙酸（ALA）、膽色素原（PGB）、糞卟啉原Ⅲ（CoprogenⅢ），原脫植基葉綠素a（Pchlide a）、葉綠素a（Chlorophyll a）、葉綠素b（Chlorophyll b）和類胡蘿卜素（Carotenoid）在返綠葉中的含量均高于白化葉，在Mg-proto Ⅸ之前的原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）的含量在兩種葉片中的差異并不顯著（P>005），但由于Pchlide a合成受阻，導致之后的各前體物質含量在兩種葉片中都差異顯著（P<005）（表2）。

將返綠葉測得的各物質含量定為100%，并與白化葉測得的含量進行比較（圖4），其中ALA、PGB、CoprogenⅢ、ProtoⅨ和 Pchlide a合成的各前體物質含量均為返綠葉高于白化葉，或是差異不顯著（P>005），但Mg-原卟啉Ⅸ（Mg-proto Ⅸ）的含量卻是白化葉高于返綠葉，并且差異顯著（P<005）。從圖4可以發(fā)現(xiàn)，這是由于Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時受阻，導致Mg-proto Ⅸ積累，因此，白化葉中的Mg-proto Ⅸ含量高于返綠葉。

24與葉綠素合成相關基因在安吉白茶白化葉和返綠葉中的表達量

對安吉白茶的白化葉和返綠葉進行Real time-PCR分析結果如圖5：谷氨酰tRNA還原酶1基因（HEMA1）在白化葉中的表達量是返綠葉中的060倍，白化轉綠基因（gra（t））在白化葉中的表達量是返綠葉中的052倍，核糖核酸還原酶大亞基基因（RNRL1）在白化葉中的表達量是返綠葉中的058倍，鎂原卟啉原 IX 單甲酯環(huán)化酶基因（CRD1）在白化葉中的表達量是返綠葉中的077倍。以上各基因表達差異較大，HEMA1、gra（t）、RNRL1在白化葉中的表達量均比返綠葉中的表達量低。

鎂原卟啉原 IX 單甲酯環(huán)化酶基因（CRD1）編碼的蛋白主要功能是催化Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a，CRD1在白化葉中表達量低，與本實驗室對白化葉和返綠葉葉綠素及其前體物質含量的測定結果相一致。其次，與葉綠素合成相關的基因HEMA1、gra（t）、RNRL1在白化葉中的表達量均低于返綠葉，使白化葉中葉綠素含量低于返綠葉。

3結論與討論

葉綠體的發(fā)育異常和葉綠素的合成受阻都會導致植物發(fā)生葉色突變[13-14]，本研究通過對白化葉葉綠體超微結構的觀察發(fā)現(xiàn)，白化葉葉綠體基粒片層排列疏松散亂甚至斷裂不成形，只有些許類囊體殘留（圖2），推測白化葉的葉綠體是在其發(fā)育階段中的基粒構建階段受到影響，其葉綠體發(fā)育受到影響而導致安吉白茶葉白化。同時在對兩種葉片葉綠素及其前體物含量測定（表2、圖4）時發(fā)現(xiàn)，白化葉中Mg-原卟啉Ⅸ（Mg-proto Ⅸ）含量高于返綠葉，推測是因為葉綠素合成階段中Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時受阻，使Mg-proto Ⅸ在白化葉片中積累[15]，使白化葉中Mg-proto Ⅸ含量高于返綠葉。對白化葉和返綠葉中與葉綠素合成的相關基因表達量測定時發(fā)現(xiàn)，編碼催化Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a的鎂原卟啉原 IX 單甲酯環(huán)化酶[16]的基因（CRD1）在白化葉中的表達量要低于返綠葉（圖5），其他與葉綠素合成相關的基因（HEMA1、gra（t）、RNRL1）[17]在白化葉中的表達量均低于返綠葉（圖5），使安吉白茶在白化過程中的葉綠素合成減少，葉片發(fā)生白化。對類胡蘿卜素含量的測定發(fā)現(xiàn)，白化葉中類胡蘿卜素的含量低于返綠葉，葉綠素沒有類胡蘿卜素的保護，也會使葉綠素含量進一步降低[18]（表2、圖4）。

通過上述對安吉白茶兩個階段的葉綠體超微結構的觀察和對葉綠素及其前體物質含量的測定發(fā)現(xiàn)，安吉白茶在白化期葉綠體結構異常，同時葉綠素合成受阻，本研究推測是由于在葉綠素合成階段Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時受阻及葉綠體發(fā)育不良導致安吉白茶在白化期白化。

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