胡江 王嘉福 牛熙 李升 冉雪琴

摘要：地方豬種在長(zhǎng)期的馴化和進(jìn)化過程中，由于遺傳變異導(dǎo)致其一些功能基因缺失，從而形成了地方豬種的差異性。本研究對(duì)重測(cè)序的54頭地方豬種進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)貴州地方豬種特有的結(jié)構(gòu)變異基因有36個(gè)，這些基因?qū)F州地方豬種的生長(zhǎng)、繁殖、消化、能量代謝等功能造成了一定的缺失;歐洲豬種特有的結(jié)構(gòu)變異基因有10個(gè)，這些基因?qū)W洲豬種的能量代謝、免疫能力、肉質(zhì)的嫩度等方面的功能造成缺失;中國(guó)地方豬種特有功能缺失的結(jié)構(gòu)變異基因有14個(gè)，這些基因?qū)χ袊?guó)地方豬種的味覺、免疫、生長(zhǎng)發(fā)育等方面的功能造成缺失。通過上述研究為地方豬種的差異性基因挖掘與探討提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地方豬種;結(jié)構(gòu)變異;功能缺失;重測(cè)序

中圖分類號(hào)：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）06-00064-07國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.012

Comparison of Releated Genes to Funtional Loss between Guizhou Local Pig Breeds and Other Pig Breeds

HU Jiang1，WANG Jia-fu1，3*，NIU Xi1，LI Sheng1，RAN Xue-qin2

（1College of Life Sciences and Institute of Agro-Bioengineering/ The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （ Ministry of Education），Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;3Tongren University，Tongren Guizhou 554300，China）

Abstract：：In the process of long-term training and evolution of local pig breeds，because of genetic variation some functions lost were resulted in certain genes，thus forming local difference in pig breedsIn this study，54 species of re-sequencing were tested for structural variationThe results showed that 36 unique structural variant genes in Guizhou local pig breeds were found，which cause the function loss of growth，reproduction，digestion and energy metabolismWhile in European pig breeds，10 unique structural variant genes were identified，which lack the functions of energy metabolism，immunity，and tenderness; However，there are 14 variant genes，which are deficient in the functions of taste，immunity，growth and development of Chinese local pig breedsIn short，the results provides a certain theoretical basis for excavating and discussing the differential genes of local pig breeds

Key words：local pig breeds; structural variation; loss of function; resequencing

豬是大約10000年前在近東和中國(guó)地區(qū)被人類最早馴化的動(dòng)物之一[1]，豬是一種十分重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，在消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心臟、腎臟、等組織結(jié)構(gòu)上與人都非常相似[2]，我國(guó)在豬的生產(chǎn)養(yǎng)殖和豬肉消耗量上占據(jù)了全世界的一半[3]，我國(guó)在養(yǎng)殖豬這一產(chǎn)業(yè)上占據(jù)了舉足輕重的地位[4]，豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與人類的生活質(zhì)量密切相關(guān)[5]，因此，豬種的品質(zhì)、肉質(zhì)、繁殖、疾病等方面的特質(zhì)表型成為了研究迫切解決的問題。到目前為止，不僅豬的參考基因組已被更新至111版本（Sscrofa111），而且豬基因組測(cè)序的質(zhì)量和豬種注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)都有很大的改進(jìn)，這有利于從功能基因組學(xué)的層面對(duì)豬種進(jìn)行研究，同時(shí)也為豬的分子育種奠定了基礎(chǔ)[6]。

對(duì)物種來講，結(jié)構(gòu)變異（Structural variation，SV）會(huì)帶來巨大的影響，例如：結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致細(xì)胞癌變[7]，神經(jīng)表達(dá)基因的變異導(dǎo)致精神分裂[8];但某些結(jié)構(gòu)變異也會(huì)對(duì)物種適應(yīng)新的環(huán)境產(chǎn)生有利影響[9]，結(jié)構(gòu)變異的基因也可能是豬種進(jìn)化產(chǎn)生的一個(gè)分支點(diǎn)，與豬的進(jìn)化密切相關(guān)[10]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，當(dāng)前已經(jīng)在動(dòng)物、植物上取得了重大進(jìn)展。

功能缺失是指在染色體上的基因由于發(fā)生突變而導(dǎo)致堿基序列的改變，發(fā)生了功能的改變或者喪失，β-肌動(dòng)蛋白基因（ACTB）的突變會(huì)導(dǎo)致人的智力障礙、皮質(zhì)畸形、神經(jīng)性耳聾[11]。骨髓免疫受體（TREM2）基因的變異會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)性疾病的產(chǎn)生，骨髓免疫受體如果缺失，導(dǎo)致其配體無法與之結(jié)合，從而導(dǎo)致阿茨海默癥疾病的發(fā)生[12]。胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF2）基因發(fā)生突變之后對(duì)IGF2的剪接受體有較大的影響，導(dǎo)致其功能發(fā)生了喪失[13]。

本文利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)中國(guó)地方豬種、貴州地方豬種、歐洲豬種進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)，對(duì)地方豬種的功能缺失基因進(jìn)行初步探究。地方豬種在長(zhǎng)期的進(jìn)化選擇中，形成了十分豐富的遺傳資源。產(chǎn)生了一些適應(yīng)于地方豬種生存的優(yōu)質(zhì)基因，通過三個(gè)地方豬品種的比較，從基因組學(xué)的層面對(duì)貴州地方豬種進(jìn)行探究，有利于對(duì)貴州地方豬種的優(yōu)質(zhì)特異基因進(jìn)行挖掘與保護(hù)，使得貴州地方豬種的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到全面的完善，提高經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)對(duì)分子水平上去研究貴州地方豬種的相關(guān)特異性提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)材料

對(duì)18頭貴州地方豬種進(jìn)行樣品采集，采集的方法分為血液采集和耳組織采集，將采集的血液樣品及耳組織樣品凍存于-80℃的超低溫冰箱中。18頭貴州地方豬種采樣信息如下表1。

12實(shí)驗(yàn)方法

121重測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控

為了從重測(cè)序的數(shù)據(jù)中得到高質(zhì)量的讀數(shù)，使用NGSQC Toolkit軟件對(duì)重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理。

122序列比對(duì)

將從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載的豬參考基因組111版本，使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件將質(zhì)控后的高質(zhì)量序列與參考基因組比對(duì)。利用samtools軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換并進(jìn)行排序，得到BAM文件進(jìn)行后續(xù)分析。

123結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)及合并

使用SoftSV、Pindel軟件分別對(duì)18頭貴州地方豬種（GZP）的結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SoftSV檢測(cè)出453682個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn);Pindel檢測(cè)出400，779個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)。兩個(gè)軟件合并取交集得到190，411個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)。36頭豬的重測(cè)序數(shù)據(jù)利用相同的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)。歐洲豬種（EUP）利用SoftSV、Pindel軟件分別檢測(cè)到了125，503和96，530個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)，合并取交集得到56，562個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)。中國(guó)地方豬種（NPOG）使用SoftSV、Pindel軟件分別檢測(cè)到125，503和96，530個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)，合并取交集得到163，876個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)[14]。

根據(jù)SVmerge軟件的合并原理，將貴州地方豬種的數(shù)據(jù)、中國(guó)地方豬種、歐洲豬種的結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行合并，獲得結(jié)構(gòu)變異39，166個(gè)。

124生物信息學(xué)分析

利用MG2C軟件進(jìn)行基因定位;使用GO和KEGG對(duì)其功能進(jìn)行聚類和富集分析;利用基迪奧云平臺(tái)制作韋恩圖，探究各個(gè)地方豬種中特有的結(jié)構(gòu)變異基因。

2結(jié)果與分析

21重測(cè)序數(shù)據(jù)

經(jīng)過序列質(zhì)控、比對(duì)、排序、變異位點(diǎn)的檢測(cè)、注釋一系列步驟之后，得到39166個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)。從39166個(gè)變異位點(diǎn)中分析出17063個(gè)結(jié)構(gòu)變異發(fā)生在編碼蛋白區(qū)域，進(jìn)一步對(duì)17063個(gè)注釋的結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有基因名稱的結(jié)構(gòu)變異有14512個(gè)，分析發(fā)現(xiàn)，有176個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)在外顯子區(qū)域發(fā)生了變異（圖1）。

由于在外顯子區(qū)域上發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異會(huì)對(duì)功能造成極大的影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響蛋白功能在物種中的表達(dá)。因此選擇在外顯子區(qū)域發(fā)生有結(jié)構(gòu)變異的176個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。

22染色體定位

對(duì)176個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)在染色體結(jié)構(gòu)上進(jìn)行定位（圖2和圖3），從圖中可知：大多數(shù)的結(jié)構(gòu)變異發(fā)生在染色體的兩端;從結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量上來看，發(fā)生在染色體1號(hào)和染色體9號(hào)上的結(jié)構(gòu)變異最多，在15號(hào)染色體和16號(hào)染色體上發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異基因最少。

從結(jié)構(gòu)變異發(fā)生在染色體的位置來看，染色體末端可能是發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的高頻區(qū)，這些發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的區(qū)域可能會(huì)對(duì)豬種的某些功能造成較大的影響。

23GO富集功能分析

對(duì)176個(gè)發(fā)生在外顯子區(qū)域的結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）的分析，結(jié)果如圖4所示。

24KEGG通路分析

為了解這些基因在哪一些通路當(dāng)中，故進(jìn)行KEGG的功能分析，其結(jié)果如圖5。

從KEGG的通路分析圖中可以得出，KEGG通路主要分成Metabolism（代謝）、genetic information processing（遺傳信息過程）、environmental information processing（環(huán)境過程）、cellular processes（細(xì)胞過程）、human diseases（人類疾?。?個(gè)部分，其中在carbohydrate metabolism（碳代謝）、singal transduction（信號(hào)傳導(dǎo)）、infectious diseases（疾?。┤齻€(gè)通路上的基因數(shù)量最多。

25地方豬種特有結(jié)構(gòu)變異基因及功能

為了挖掘貴州地方豬種（GZP）、歐洲豬種（EUP）、中國(guó)地方豬種（NPOG）特有的結(jié)構(gòu)變異基因，對(duì)176個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)作了韋恩圖（圖6）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：貴州地方豬種特有的結(jié)構(gòu)變異基因個(gè)數(shù)為36個(gè);歐洲地方豬種特有的結(jié)構(gòu)變異基因個(gè)數(shù)為10個(gè);中國(guó)地方豬種特有的結(jié)構(gòu)變異基因個(gè)數(shù)為14個(gè);并通過GO和KEGG對(duì)其功能進(jìn)行了解，結(jié)果如表3所示。

3結(jié)論與討論

31貴州地方豬種功能缺失基因

貴州地方豬種特有的結(jié)構(gòu)變異基因有36個(gè)，如：BMP5、OR3A1、MAN2B2、MTMR8、DYNC1T1、FTL、BOLL等結(jié)構(gòu)變異基因。BMP5基因在TGF-beta signaling pathway（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子）通路中，其基因的功能是對(duì)骨骼的發(fā)育生長(zhǎng)相關(guān);MAN2B2基因在Other glycan degradation（聚糖降解）通路中，名稱為α甘露糖苷酶，與豬的繁殖功能相關(guān)[15];FTL基因在Mineral absorption（礦物質(zhì)吸收）通路中，其基因功能與豬種消化系統(tǒng)中對(duì)礦物質(zhì)的吸收相關(guān);DYNC1I1結(jié)構(gòu)變異基因在Vasopressin-regulated water reabsorption（血管加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收）通路中，其功能對(duì)豬的排泄系統(tǒng)有重要影響;MTMR8基因在Inositol phosphate metabolism（肌醇磷酸代謝）通路中，其基因功能與豬的能量代謝有關(guān);OR3A1結(jié)構(gòu)變異基因通過文獻(xiàn)的查閱發(fā)現(xiàn)其基因功能與嗅覺受體的活性有關(guān);BOLL結(jié)構(gòu)變異基因與公豬的精子有關(guān)[16]。這些基因在貴州地方豬種中發(fā)生了結(jié)構(gòu)變異，可能對(duì)貴州地方豬種的生長(zhǎng)、繁殖、消化、能量代謝等功能造成了一定的缺失。

32歐洲豬種功能缺失基因

歐洲豬種特有的結(jié)構(gòu)變異基因有10個(gè)，如ACTB、PRDX6、GANC、ABCA5等結(jié)構(gòu)變異基因，ACTB結(jié)構(gòu)變異基因在Leukocyte transendothelial migration（白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移）、Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy （心律失常性右心室心肌病，ARVC）、Thyroid hormone signaling pathway（甲狀腺激素信號(hào)通路）、Salmonella infection（沙門氏菌感染）、Hypertrophic cardiomyopathy （肥厚型心肌病，HCM）、Proteoglycans in cancer（癌癥中的蛋白多糖）等通路中都有涉及，其基因功能大多數(shù)都與疾病的形成有關(guān)，ACTB基因發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，會(huì)對(duì)豬的免疫系統(tǒng)造成影響。這些基因的變異對(duì)人造成了很嚴(yán)重的影響，但在豬種中并未具體體現(xiàn)，也表現(xiàn)出豬對(duì)這些疾病具有一定的耐受性。GANC結(jié)構(gòu)變異基因在Starch and sucrose metabolism（淀粉和蔗糖代謝）通路中，其基因功能與能量代謝相關(guān);ABCA5結(jié)構(gòu)變異基因在ABC transporters（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器）通路中，其作用是對(duì)合成的ATP進(jìn)行運(yùn)輸，與功能代謝相關(guān);PRDX6基因的功能與豬肉質(zhì)的嫩度有關(guān);通過對(duì)歐洲豬種特異結(jié)構(gòu)變異的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)能量代謝、免疫能力、肉質(zhì)的嫩度可能在歐洲豬種中發(fā)生了功能缺失。

33中國(guó)地方豬種功能缺失基因

中國(guó)地方豬種特有功能缺失的結(jié)構(gòu)變異基因有14個(gè)。如RETSAT、PATJ、TAS2R40、IGSF5等結(jié)構(gòu)變異基因，RETSAT結(jié)構(gòu)變異基因在Retinol metabolism（視黃醇代謝）通路，其作用與維生素A的形成有關(guān)，其功能與豬的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān);PATJ結(jié)構(gòu)變異基因在Hippo signaling pathway（河馬信號(hào)）通路中，其功能與細(xì)胞的增殖、凋亡有關(guān);IGSF5是免疫球蛋白超級(jí)家族中的一員，其功能與豬的免疫功能相關(guān);TAS2R40（taste 2 receptor member 40）是味覺受體基因，其功能是與味覺的靈敏度有關(guān)。這些基因發(fā)生了結(jié)構(gòu)變異可能對(duì)中國(guó)地方豬種的味覺、免疫、生長(zhǎng)發(fā)育等功能造成一定的影響，該研究結(jié)果對(duì)地方豬種的分子選育奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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