麻景梅 高樂 田宇柔 李軍山 牛麗穎

摘 要：桑葉配方顆粒迄今尚沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為提升桑葉配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，對其物質(zhì)基準(zhǔn)評價方法進(jìn)行了研究。選取具有代表性產(chǎn)地的15批桑葉制備物質(zhì)基準(zhǔn)，采用高效液相色譜法，以蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷作為評價指標(biāo)，確定桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)的出膏率范圍、標(biāo)志性成分含量及轉(zhuǎn)移率范圍，采用超高效液相色譜法，建立物質(zhì)基準(zhǔn)UPLC特征圖譜，并對其主要成分進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果表明：15批物質(zhì)基準(zhǔn)中，蘆丁轉(zhuǎn)移率為19.94%～34.05%，異槲皮苷轉(zhuǎn)移率為

11.67%～43.58%，紫云英苷轉(zhuǎn)移率為10.73%～43.05%;物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜中，標(biāo)定了14個共有峰，指認(rèn)出7個色譜峰，分別為新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-O-（6″-O-丙二?；?β-D-葡萄糖苷、紫云英苷。所建立的基準(zhǔn)評價方法為桑葉配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及其后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);桑葉;配方顆粒;物質(zhì)基準(zhǔn);轉(zhuǎn)移率;特征圖譜

中圖分類號：R284.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi： 10.7535/hbgykj.2019yx06010

文章編號：1008-1534（2019）06-0429-07

Abstract：So far， there is no unified quality standard for Mulberry leaf formula granules. In order to improve the intrinsic quality of Mulberry leaf formula granules， the substance benchmark evaluation method is studied. 15 batches of Mulberry leaf from representative producing areas are selected to prepare the substance benchmark， and with rutin， isoquercetin， astragalin as evaluation indexes， the extract rate， the iconic component content and the transfer rate range of Mulberry leaf substance benchmark are determined by high performance liquid chromatography. By using the ultra high performance liquid chromatography method， the substance benchmark UPLC feature chromatograms is established， and its main components are identified. The results show that the transfer rates of rutin，isoquercitrin and astragalin are 19.94%～34.05%， 11.67%～43.58% and 10.73%～43.05%， respectively. In the substance benchmark feature chromatograms， fourteen common peaks are identified， and seven chromatographic peaks are identified including neochlorogenic acid， chlorogenic acid， caffeic acid， rutin， isoquercetin， quercetin 3-O-（6″-O-malonyl） -beta-D-glucoside and astragalin. The established benchmark evaluation method provides a data basis for the formulation of quality standards of mulberry leaf formula granules and subsequent mass production.

Keywords：chemistry of Chinese material medica; Mulberry; formula granule; substance benchmark; transfer rate; feature chromatograms

桑葉為桑科植物桑Morus alba L.的干燥葉，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目的功效，用于治療風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花等[1]。桑葉中含有黃酮及黃酮苷類、生物堿類、多糖類等活性成分。黃酮及黃酮苷類是桑葉的主要藥效成分，含有蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素等?，F(xiàn)代藥理研究表明，桑葉具有抗凝血、調(diào)血糖、調(diào)血脂、抗病毒等功效[2-5]。

目前，有關(guān)桑葉飲片化學(xué)成分及特征圖譜方面的研究較多，但桑葉配方顆粒沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，針對其基準(zhǔn)的研究尚未見報道。隨著中藥配方顆粒臨床應(yīng)用的快速發(fā)展，迫切需要建立相應(yīng)的整體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本研究選用道地及主產(chǎn)區(qū)符合標(biāo)準(zhǔn)的15批桑葉飲片制備桑葉配方顆粒的物質(zhì)基準(zhǔn)，以蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷作為標(biāo)志性成分，通過測定其含量，計算標(biāo)志性成分的轉(zhuǎn)移率，采用UPLC建立特征圖譜研究方法，并對其主要成分進(jìn)行指認(rèn)。

1?主要儀器與試劑

1.1?儀器

超高效液相色譜系統(tǒng)，美國沃特世公司提供;LC-15C島津高效液相色譜儀，日本島津公司提供;Pilot5-8L真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司提供;TB-215D萬分之一分析天平、BSA224S-CW十萬分之一分析天平，北京賽多利斯有限公司提供;JY10001電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司提供;KQ-250型超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司提供;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠提供;BJH-W200F型陶瓷自動中藥煲，廣東天際電器股份有限公司提供;梅特勒-托利多pH計，國際貿(mào)易上海有限公司提供;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司提供。

1.2?試劑

新綠原酸（批號為PY20170220，純度為99.78%），咖啡酸（批號為110885-200102，純度為100.00%），綠原酸（批號為PY20170216，純度為99.96%），均購自中國食品藥品檢定研究院;蘆丁（批號為MUST-16031813），購自成都曼斯特生物科技有限公司;異槲皮苷（批號為16052407）、紫云英苷（批號為150712），均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;槲皮素-3-O-（6″-O-丙二酰基）-β-D-葡萄糖苷（批號為170924），購自上海源葉生物技術(shù)有限公司;色譜甲醇、色譜乙腈、色譜純磷酸，F(xiàn)isher化學(xué)試劑公司提供;超純水，自制;其他試劑均為分析純。

15批桑葉飲片均由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司統(tǒng)一采購提供，經(jīng)河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任藥師鑒定為?？浦参锷orus alba L. 的干燥葉，飲片信息見表1。

2?方法與結(jié)果

2.1?物質(zhì)基準(zhǔn)的制備[6-8]

稱取15批次的桑葉飲片各約100.0 g，煎煮2次。第一煎加12倍量的水，浸泡30 min，煮沸后煎煮20 min，用0.074 μm（200目）濾布趁熱濾過，將濾液置于水浴中迅速冷卻;第二煎加10倍量的水，煮沸后煎煮20 min，用0.074 μm（200目）濾布趁熱濾過，將濾液置于水浴中迅速冷卻。合并濾液，減壓濃縮（溫度為50 ℃）成浸膏（投料量∶浸膏體積=1 g∶2 mL）的，測定其pH值、密度，冷凍干燥后，即得物質(zhì)基準(zhǔn)干膏粉。按照式（1）計算出膏率，并測定物質(zhì)基準(zhǔn)水分，見表2。

出膏率= 干膏粉質(zhì)量/飲片質(zhì)量×100%。（1）

2.2?標(biāo)志性成分的含量測定[9-12]

2.2.1?色譜條件

色譜柱為Waters C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相A為乙腈，流動相B為0.5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）磷酸，按照表3中的色譜條件進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為358 nm，柱溫為35 ℃，理論板數(shù)按蘆丁峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2?混合對照品溶液的制備

分別精密稱取蘆丁對照品、異槲皮苷對照品和紫云英苷對照品適量，加色譜甲醇溶解并定容，制成每l mL含蘆丁0.020 9 mg、異槲皮苷0.045 0 mg和紫云英苷0.010 2 mg的混合對照品溶液。

2.2.3?供試品溶液的制備

取物質(zhì)基準(zhǔn)干膏粉0.5 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入70%甲醇20 mL，超聲處理10 min，取出，室溫放置，用70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，過濾。

2.2.4?方法學(xué)考察

1）桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)色譜圖

蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的HPLC色譜圖見圖1。

2）線性關(guān)系試驗

精密吸取混合對照品溶液2，4，6，10，14，20 μL，分別注入高效液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：蘆丁在0.041 8～0.418 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.749 8×106X+1.396 9×104，r=0.999 9;異槲皮苷在0.09～0.90 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=2.611 7×106X+4.242 4×104，r=1.000 0;紫云英苷在0.020 4～0.204 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=2.161 324×106X+8.206×103，r=1.000 0。

3）精密度試驗

精密吸取對照品溶液5 μL，依法連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算蘆丁、異槲皮苷與紫云英苷峰面積的RSD值，結(jié)果分別為0.73%，1.22%和1.69%，RSD值均小于2.0%，說明儀器的精密度良好。

4）穩(wěn)定性試驗

吸取同一相應(yīng)的供試品溶液，每隔一定時間進(jìn)樣，測定峰面積，計算蘆丁、異槲皮苷與紫云英苷峰面積的RSD值，分別為0.94%，2.11%和2.05%（n=6），表明該供試品溶液的標(biāo)志性成分在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

5）重復(fù)性試驗

取同一批桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)干膏粉6份，每份約0.5 g，依法分別制得各供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL進(jìn)行測定，分別計算供試品溶液中蘆丁、異槲皮苷與紫云英苷含量的RSD值，分別為1.47%，4.59%和3.72%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

6）加樣回收率試驗

取同一批已知含量的桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)干膏粉6份，各約0.5 g，精密加入含一定量蘆丁、異槲皮苷與紫云英苷的提取溶劑，依法制得各供試品溶液，進(jìn)行測定。蘆丁、異槲皮苷與紫云英苷的平均加樣回收率分別為100.68%，99.59%和100.46%（n=6），表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.5?樣品測定

分別測定15批桑葉飲片和物質(zhì)基準(zhǔn)中標(biāo)志性成分蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的含量，計算標(biāo)志性成分的轉(zhuǎn)移率[13-15]。結(jié)果見表4。

2.3?特征圖譜[13-15]

2.3.1?色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相A為0.5%磷酸溶液，流動相B為乙腈，按照表5色譜條件進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，檢測波長為358 nm，柱溫為35 ℃。

2.3.2?對照品溶液的制備

分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-O-（6″-O-丙二酰基）-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷對照品適量，加甲醇溶解并稀釋至各對照品質(zhì)量濃度分別為1.42，23.71，5.62，24.80，22.26，46.37和16.23 μg/mL的混合溶液。

2.3.3?供試品溶液的制備方法

供試品溶液制備方法如2.2.3項所述。

2.3.4?特征圖譜方法學(xué)考察

1）精密度試驗考察

取同一供試品溶液，按照特征圖譜色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結(jié)果均小于3.0%，表明該儀器的精密度良好。

2）穩(wěn)定性試驗考察

取同一供試品溶液，于供試品制備后0，2，4，8，12 h注入UPLC儀，記錄各色譜峰的峰面積，計算共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值，結(jié)果均小于3.0%，表明該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3）重復(fù)性試驗考察

稱取同一批號樣品6份，各0.1 g，精密稱定，采用“2.2.3”項所述方法制備供試品溶液，按特征圖譜色譜條件進(jìn)樣，記錄各色譜峰的峰面積，計算共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值，結(jié)果均小于3.0%，說明該特征圖譜方法的重復(fù)性符合要求。

2.3.5?特征圖譜

分別制備15批桑葉飲片、配方顆粒物質(zhì)基準(zhǔn)的供試品溶液，按特征圖譜色譜條件進(jìn)行測定，采用 “中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）對15批桑葉飲片、配方顆粒物質(zhì)基準(zhǔn)特征色譜圖進(jìn)行匹配，分別得到飲片與物質(zhì)基準(zhǔn)的對照特征圖譜。桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)中標(biāo)定了14個共有峰，其中指認(rèn)1號色譜峰、2號色譜峰、3號色譜峰、8號色譜峰、9號色譜峰、10號色譜峰、12號色譜峰分別為新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-O-（6″-O-丙二?；?β-D-葡萄糖苷、紫云英苷。15批桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)與對照特征圖譜間的相似度均大于0.8，特征圖譜相似度符合要求。由于《中華人民共和國藥典》2015年版桑葉項下將蘆丁定為含量測定的指標(biāo)成分，且蘆丁分離度較好、穩(wěn)定，故選擇其作為參照峰（S）。UPLC色譜圖見圖2。

2.3.6?特征圖譜相關(guān)性分析

采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）比較桑葉飲片、物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜，對其共有峰進(jìn)行對比分析，桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)中14個特征峰均在桑葉飲片中存在，證明桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)與飲片化學(xué)成分基本一致，相似度見表6。

3?討?論

3.1?供試品溶液的制備

由于桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)在制備過程中標(biāo)志性成分已被煮提出來，因此制備供試品溶液時采用超聲溶解即可，對提取溶劑和超聲時間進(jìn)行考察。結(jié)合《中華人民共和國藥典》2015年版桑葉項下供試品提取溶劑為甲醇，故以50%甲醇、70%甲醇和甲醇作為提取溶劑進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以70%甲醇為提取溶劑時，各成分提取較為完全，故選用70%甲醇作為提取溶劑。選擇超聲時間為10，20，30，40 min對標(biāo)志性成分提取率進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)超聲時間對桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的提取率影響無差別。為了節(jié)省時間，提高試驗效率，故選擇10 min進(jìn)行超聲提取。

3.2?色譜條件的確定

依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版桑葉項下含量測定色譜條件，采用甲醇-0.5%磷酸梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)蘆丁與異槲皮苷的色譜峰完全重合，二者極性相近不易達(dá)到分離。經(jīng)過對色譜柱、流動相比例等進(jìn)行研究，最終發(fā)現(xiàn)流動相為乙腈-0.5%磷酸，采用梯度洗脫時，二者的分離效果良好，且紫云英苷與相鄰色譜峰也達(dá)到完全分離。依此確定了3種指標(biāo)成分同時定量的液相色譜方法，并且在此流動相基礎(chǔ)上確定了UPLC特征圖譜的色譜條件。

4?結(jié)?語

1）《中華人民共和國藥典》2015年版僅以蘆丁單一成分為指標(biāo)對桑葉進(jìn)行含量測定。本研究以物質(zhì)基準(zhǔn)中水溶性成分的檢出為目的，以多成分檢出為導(dǎo)向，建立了對桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷3種成分同時進(jìn)行測定的方法，同時采用UPLC建立了桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜的分析方法，不僅節(jié)省了分析時間，還提高了桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2）物質(zhì)基準(zhǔn)作為衡量中藥配方顆粒的基準(zhǔn)參照物，代替了對照品，更能體現(xiàn)中藥的整體性，完善了中藥質(zhì)量控制理念，離實現(xiàn)中藥整體質(zhì)量控制的目標(biāo)越來越近。本研究通過選取具有代表性產(chǎn)地的15批桑葉制備物質(zhì)基準(zhǔn)，確定了桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)的出膏率范圍、標(biāo)志性成分含量及轉(zhuǎn)移率范圍，以及特征圖譜的特征峰，為評價桑葉配方顆粒整體質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

3）槲皮素-3-O-（6″-O-丙二?；?β-D-葡萄糖苷在桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)中的含量較高，能反映桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量，但由于其對照品價格昂貴且不易得，故未對其進(jìn)行含量測定，僅在特征圖譜中對其進(jìn)行了指認(rèn)。后期將繼續(xù)以蘆丁為對照品，對桑葉物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行一測多評方法方面的研究。

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