姚佳

【摘 要】探討長鏈非編碼 RNA LINC011614在三陰性乳腺癌中的表達水平作用。方法：采用實時定量PCR方法，檢測不同乳腺癌細胞株與正常乳腺上皮細胞系，乳腺癌組織與癌旁組織中的表達量。構(gòu)建敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，采用CCK8、流式細胞檢測術、細胞克隆及劃痕等功能實驗檢測LINC01614與增殖和遷移能力的變化。結(jié)果：LINC01614 在TNBC細胞和乳腺癌組織中均明顯高于正常細胞及癌旁組織;敲低LINC01614后細胞增殖及遷移能力減弱，細胞周期阻滯。結(jié)論：LINC01614在乳腺癌中高表達且參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，機制可能與其過表達可促進乳腺癌細胞增殖，并促進轉(zhuǎn)移有關，可作為乳腺癌預后預測和治療的潛在靶點。

【關鍵詞】三陰性乳腺癌;長鏈非編碼RNA;LINC01614

乳腺癌具有高度異質(zhì)性，是全球女性第二大癌癥相關死因。我國近10余年發(fā)病率逐年攀升，在一些大中型城市，乳腺癌已然成為嚴重危害女性健康的最常見惡性腫瘤[1]。目前對乳腺癌的主要治療手段為手術治療結(jié)合術后放化療及內(nèi)分泌治療的綜合治療，尤其是蒽環(huán)類和紫杉醇等抗癌藥為主的化療方案的逐步應用，乳腺癌病人術后的生存率明顯較大提高。然而長期的聯(lián)合化療會使乳腺癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，進展期乳腺癌患者常常因腫瘤對化療藥物的多藥耐藥，導致化療失敗，腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移，嚴重影響生活質(zhì)量和長期生存率。惡性骨腫瘤多發(fā)并難以治愈， 超過一半的晚期前列腺癌和乳腺癌患者會出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[2-3]。因此，尋求其他有效的治療手段，已成為目前乳腺癌治療研究的熱點。

乳腺癌是一個多因素、多基因參與、多階段形成的復雜的異質(zhì)性疾病，病程中伴隨著有害突變的積累、基因組不穩(wěn)定性的增加、表觀遺傳學修飾的改變以及眾多癌基因和抑癌基因的功能和表達異常的分子事件。長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA ， LncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的RNA[4]，本身并不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上影響基因的表達，與基因沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色體構(gòu)型修飾等密切相關，其表達異常亦可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預后[5]。目前有研究表明某些LncRNA僅會編碼幾個至十幾個氨基酸的Microprotein，并與特定疾病關系密切[6]。研究表明，HOTAIR（HOX transcript antisense RNA ， HOTAIR）與乳腺癌的預后，細胞干性和臨床病理特征相關[7-8]。而LncRNA LSINCT5則能夠在乳腺癌和卵巢癌中高表達并且調(diào)控腫瘤細胞的增殖，影響腫瘤的侵襲[9]。LncRNA在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用的機制初現(xiàn)端倪，但仍有待深入探究。

LINC01614在肺癌中高表達，而敲除LINC01614后可以通過上調(diào)mir-217和下調(diào)foxp1抑制肺腺癌細胞的進展[10-11]。LINC01614在乳腺癌組織中顯著高表達 [12]。有研究報道LINC01614通過TGFβ和FAK信號通路參與乳腺癌不良預后的調(diào)控，一般情況而言不良預后往往伴隨著腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移[12]。三陰性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）由于腫瘤分化程度低、異質(zhì)性高、侵襲及轉(zhuǎn)移臟。

故本研究圍繞LINC01614與三陰性乳腺癌的增殖及轉(zhuǎn)移展開研究。

1 實驗材料及方法：

1.1 收集本院 2018年 1 月至 2018 年 6月女性乳腺癌患者手術切除的 10對癌組織和癌旁組織，均經(jīng)病理組織學證實為三陰性乳腺癌，術前均未行抗腫瘤治療，手術切除的組織立即冷凍于-80 ℃以用于提取 RNA。

1.2 細胞及試劑：正常人乳腺細胞系MCF10A和人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468購于美國模式培養(yǎng)物保藏所細胞庫。培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國 BI公司。 RNeasy Mini Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒QuantiTect Reverse Transcription Kit 和 QPCR 試劑盒QuantiTect SYBR Green PCR Kit 購自日本takara公司，LINC01614和內(nèi)參 GAPDH 引物由杭州有康生物公司合成。CCK8及流式周期試劑盒均購于江蘇碧云天生物公司。LINC01614干擾的慢病毒及對照由上海吉凱基因公司提供。

1.3 實驗方法：

1.3.1 細胞培養(yǎng)：乳腺癌細胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7）及正常乳腺細胞系MCF10A使用10%胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基，均在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 CCK8法檢測：將細胞打成懸液，密度為2×104個/ml的單細胞懸液。按照每孔100μl的體積接種到96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設置6個復孔，同時設置空白組（只加培養(yǎng)基）。將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h和120h時將原培養(yǎng)基更換含為100μl含10%CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中孵育1h后，測定450nm 波長下各孔的光密度（OD）值。所測各組OD值減去空白組OD值的平均值即為各組的實際OD值，以24h的OD值為基準值，計算不同時間點各組細胞的增殖速率（實際OD值/基準值×100%）。

1.3.3克隆形成實驗檢測細胞體外克隆形成能力：將細胞打成懸液，按250個/ml的密度接種含6孔板中，每孔2ml。將培養(yǎng)板置入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，用4%多聚甲醛固定細胞后洗去染色液，將6孔板倒置于空氣中干燥。用相機拍攝每孔克隆形成情況，并用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。

1.3.4 PI單染流式細胞術檢測細胞周期：將細胞懸液轉(zhuǎn)入15ml離心管中，收集并調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，取1ml單細胞懸液。加入100%冷乙醇4ml固定，4℃保存過夜。將 Rnase A：PI 工作液按 1：9 體積配制成PI/RNase A染色工作液。染色前用 PBS 洗去固定液，2000rpm離心5min。加入500μl染色液，室溫避光孵育30-60min后上機檢測。

1.3.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力：將細胞接種在6孔板中，待細胞融合度達100%時，使用移液器頭垂直劃出3個間隔，置于含不同干預因素的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于0、24和48 h分別拍照，比較劃痕寬度。

1.3.6 RT-qPCR 檢測LINC01614 表達組織或細胞經(jīng) Trizol法提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，使用 ABI-7500PCR 儀進行擴增和檢測，并分析計算其表達量。引物序列：LINC01614 F： 5′-AACCAAGAGCGAAGCCAAGA-3; R：5′-GCTTGGACACAGACCCTAGC-3′; GAPDH F： 5′-CTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCAT-3′; R： 5′-TGGAATCATATTGGAACATGTAAACC-3′。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，使用Graphpad Prism 7 軟件制作圖像。所有數(shù)據(jù)均為至少3 次獨立重復實驗的平均結(jié)果。計量數(shù)據(jù)用平均值±標準差來表示。當兩組獨立樣本滿足正態(tài)分布及方差齊性時，采用t檢驗，否則采用校正t檢驗或非參數(shù)檢驗。多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 時認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果：

2.1 LINC01614 在TNBC細胞和組織中均高表達

首先在乳腺癌細胞系中檢測LINC01614的表達水平，發(fā)現(xiàn)LINC01614在TNBC細胞系的表達水平遠遠高于MCF10A（圖1A）;接著檢測TNBC組織中LINC01614的表達水平，LINC01614在TNBC組織的表達水平高于癌旁組織（圖1B）。初步說明LINC01614在乳腺癌惡性腫瘤TNBC中是高表達的，可能與TNBC的增殖與轉(zhuǎn)移相關。

2.2 LINC01614敲低影響TNBC細胞系MDA-MB-231的增殖和凋亡;

敲低LINC01614后MDA-MB-231細胞的增殖能力變?nèi)?，并出現(xiàn)細胞周期阻滯情況，G1期細胞比例增加同時伴隨著細胞凋亡變多（圖2B-D）;克隆形成實驗進一步驗證MDA-MB-231敲低后細胞增殖能力減弱（圖E）

2.3 LINC01614敲低影響TNBC細胞系MDA-MB-231遷移

劃痕實驗檢測敲低LINC01614是否影響細胞的遷移，發(fā)現(xiàn)敲低LINC01614后細胞遷移能力減弱（圖3）

3 討論：

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥，而三陰性乳腺癌 （TNBC） 是乳腺癌中惡性程度最高的一個亞型，且治療方式極其有限。與其它亞型相比，TNBC患者容易復發(fā)及轉(zhuǎn)移，預后較差。因此，為改善TNBC患者的預后，亟需進一步探索TNBC可能的分子病理學機制，以尋找新的診斷標志物以及治療靶點[13-14]。LncRNA近年來被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，其可通過表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達等多種方式參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲遷移以及腫瘤血管生成等生物學行為[15-16]。

LINC01614在肺癌中高表達，而敲除LINC01614后可以通過上調(diào)mir-217和下調(diào)foxp1抑制肺腺癌細胞的進展[10-11]。LINC01614通過TGFβ和FAK信號通路參與乳腺癌不良預后的調(diào)控。三陰性乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移臟器能力強、復發(fā)率高，且缺乏有效的治療手段，預后極差，是乳腺癌臨床治療的重大難題。然而，LINC01614在三陰性乳腺癌中的表達及轉(zhuǎn)移相關性未曾有報道。

本研究檢測了三陰性乳腺癌組織及細胞系中LINC01614的表達水平，以進一步證實LINC01614在三陰性乳腺癌中的表達是否上調(diào)。與其他類型腫瘤中的報道一致，乳腺癌組織的LINC01614水平較正常組織升高。該結(jié)果有力地提示了 LINC01614 作為檢測三陰性乳腺癌潛在生物標記物的可能性。

在細胞功能實驗中，敲低LINC01614的表達后，細胞增殖能力顯著降低，細胞周期阻滯于G1期，并且凋亡數(shù)量增加。劃痕實驗進一步證明了細胞的轉(zhuǎn)移能力下降。以上結(jié)果支持 LINC01614參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，可能是三陰性乳腺癌的潛在治療靶點。

綜上所述，LINC01614在三陰性乳腺癌中高表達且參與了該腫瘤發(fā)生發(fā)展，可作為乳腺癌預后預測和治療的潛在靶點。本研究樣本量較少且未評估該指標的不良預后風險，后續(xù)將擴大樣本量進行完善。LINC01614通過何種途徑或信號通路來調(diào)控三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚，這將為今后的工作重點，后續(xù)將借助體外細胞實驗來驗證。

參考文獻：

[1]Rebecca L，Kimberly DM， Ahmedin J. Cancer statistics， 2019. A Cancer Journal for Clinicians. 2019， 69：7-34.

[2]Takeshi Y， Shinji U. Kidney cancer： Decreased incidence of skeletal-related events in mRCC. Nature Reviews Urology. 2014， 11， 193-194.

[3]Freddie B， Jacques F， Isabelle S， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA： A Cancer Journal for Clinicians. 2018， 68， 394-424.

[4]Mitchell G， Ido A， Manuel G， et al. Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals， Nature， 2009，458：223-227

[5]Daniel C， 1 Ryan P， Daniel T， et al. Long noncoding RNAs， chromatin， and development，2010， Scientific World Journal. 2010; 10： 90–102

[6]Sebastiaan H， Witte F， Schneider-Lunitz V， et al. The Translational Landscape of the Human Heart， Cell. 2019 ，178（1）：242-260

[7]Pádua C， Fonseca S， Muys R， et al. Brief report： The lincRNA Hotair is required for epithelial-to-mesenchymal transition and stemness maintenance of cancer cell lines. Stem Cells. 2013 ，31（12）：2827-32

[8]Bayram S， Sümbül AT， Dada? E. A functional HOTAIR rs12826786 C>T polymorphism is associated with breast cancer susceptibility and poor clinicopathological characteristics in a Turkish population： a hospital-based case-control study. Tumor Biology， 2016，37（4）：5577-84.

[9]Silva M， Boczek J， Berres W， et al. LSINCT5 is over expressed in breast and ovarian cancer and affects cellular proliferation. RNA Biology. 2011 ，8（3）：496-505

[10]Yan Sun， Chunhua Ling， Analysis of the long non-coding RNA LINC01614 in non-small cell lung cancer. Medicine. 98（30）：e16437

[11]Liu AN， Qu HJ， Yu CY ， et al. Knockdown of LINC01614 inhibits lung adenocarcinoma cell progression by up-regulating miR-217 and down-regulating FOXP1. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2018 ，22（9）：4034-4044

[12]Radhakrishnan V， Hibah S， Eyad E，et al. Long non-coding RNA （lncRNA） transcriptional landscape in breast cancer identifies LINC01614 as non-favorable prognostic biomarker regulated by TGFβ and focal adhesion kinase （FAK） signaling. Cell Death Discovery. 2019; 5： 109.

[13]Bianchini G， Balko JM， Mayer IA， et al. Triple-negative breast cancer： challenges and opportunities of a heterogeneous disease[J].Nat Rev Clin Oncol，2016，13（11）：674-690.

[14]Garrido-Castro AC， Lin NU， Polyak K. Insights into Molecular Classifications of Triple-Negative Breast Cancer： Improving Patient Selection for Treatment[J].Cancer Discov，2019，9（2）：176-198.

[15]Quinn JJ， Chang HY. Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function[J].Nat Rev Genet，2016，17（1）：47-62.

[16]Schmitt AM， Chang HY. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways[J].Cancer Cell，2016，29（4）：452-463.

基金資助：

2017浙江省教育廳課題（Y201738263）