孫姍姍 羅嬌依 李剛 梁瑞強(qiáng) 曹進(jìn) 陳啟 劉英華

摘?要：目的：考察不同地域來(lái)源的乳產(chǎn)品中乳鐵蛋白的含量，為指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)和消費(fèi)者合理選擇乳制品提供科學(xué)依據(jù)，也為國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管部門制定乳制品中乳鐵蛋白最低限量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。方法：采用質(zhì)譜絕對(duì)定量方法對(duì)103批次國(guó)內(nèi)外乳原料及乳制品中乳鐵蛋白含量進(jìn)行分析，通過(guò)合成特異性標(biāo)準(zhǔn)多肽，進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果：國(guó)內(nèi)外乳原料、乳粉和液態(tài)乳中乳鐵蛋白含量平均值分別為63.0、54.6、6.4mg/100g。中國(guó)國(guó)產(chǎn)乳原料、乳粉和液態(tài)乳中乳鐵蛋白含量平均值分別為67.8、58.6、8.1mg/100g，均高于本次分析國(guó)內(nèi)外樣本量的平均值。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了不同地域來(lái)源的同類型乳產(chǎn)品中乳鐵蛋白含量相差懸殊，同品牌的相似產(chǎn)品也存在較大差異。結(jié)論：不同地域來(lái)源乳粉及乳制品中乳鐵蛋白含量差異較大，生產(chǎn)企業(yè)及消費(fèi)者應(yīng)合理選擇乳制品攝入，未來(lái)，市場(chǎng)監(jiān)管部門應(yīng)盡快制定乳粉產(chǎn)品中乳鐵蛋白最低限量的國(guó)家新標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：乳鐵蛋白;乳粉;乳粉原料;液態(tài)乳;含量分布

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種具有高生物活性的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，它來(lái)源于牛乳、人乳、山羊乳和駱駝乳等原料乳中，在初乳中的含量豐富，常乳中可經(jīng)過(guò)加工分離得到，高純產(chǎn)品可作為高價(jià)值的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[1]。由于LF多種多樣的生物學(xué)功能，其可作為藥物和營(yíng)養(yǎng)品在臨床上使用，具有良好的輔助治療協(xié)同作用[2]。2010年之前，我國(guó)對(duì)LF的研究基本處于空白，隨著國(guó)家衛(wèi)健委于2013年11月發(fā)布第11號(hào)公告[3]擴(kuò)大LF使用范圍至嬰幼兒配方食品，向乳粉、乳飲品中添加LF的產(chǎn)品迅速占領(lǐng)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)。雖然我國(guó)東北、西北和華北草原帶以及膠東半島屬于國(guó)際公認(rèn)的溫帶季風(fēng)氣候優(yōu)質(zhì)奶源帶[4]，但由于LF提取技術(shù)的限制[5]，國(guó)內(nèi)使用的LF多數(shù)依賴于進(jìn)口。這不僅導(dǎo)致乳粉產(chǎn)品價(jià)格的波動(dòng)，更使我國(guó)消費(fèi)者對(duì)國(guó)產(chǎn)乳制品的質(zhì)量產(chǎn)生質(zhì)疑。為了更準(zhǔn)確更深入地探究目前我國(guó)市場(chǎng)上流通的乳粉、乳制品以及原料粉中LF的含量真實(shí)情況，本研究針對(duì)以上幾個(gè)研究對(duì)象分析LF含量及分布特征，即LF含量與其奶源產(chǎn)地的關(guān)聯(lián)性。

目前，對(duì)于LF的分析測(cè)定方法較多，有分光光度法[6]、高效液相色譜法[7-9]、酶聯(lián)免疫吸附法[10-12]、毛細(xì)管電泳法[13-15]、表面等離共振技術(shù)[16-17]等。但本研究的分析樣本龐大，需要保證分析定量的準(zhǔn)確性與實(shí)驗(yàn)操作的便捷性，故選擇高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）。前處理簡(jiǎn)單進(jìn)行溶解后，使用少量溶解液進(jìn)行酶解后即可采用質(zhì)譜分析，質(zhì)譜法測(cè)定大幅度降低了假陽(yáng)性率的發(fā)生，并且內(nèi)標(biāo)法確保了定量的準(zhǔn)確性。

1?材料與方法

1.1?儀器與試劑

Waters UPLC-Vevo TQ-S液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、Masslynx質(zhì)譜軟件，美國(guó)沃特世科技有限公司;G2渦旋振蕩器，美國(guó)Scientific Industries公司;B-491恒溫水浴鍋，瑞士BUCHI公司;Seven Easy臺(tái)式酸度計(jì)，瑞士梅特勒公司;賀力氏21離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;ZWY-240恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司;ACQUITY UPLC HSS T3 C18親水柱（2.1mm×100mm，1.8μm），美國(guó)WATERS公司。

乳鐵蛋白特異肽段：序列為VDSALYLGSR，分子量1 080.22Da，純度≥99%。乳鐵蛋白同位素特異肽段：序列為VDSAL*YLGSR，L*（13C6，15N）同位素標(biāo)記亮氨酸，分子量1 087.22Da，純度≥95%。乳鐵蛋白同位素內(nèi)標(biāo)肽段：序列為ALGFLRIPSKVDSAL*YLGSRYLTTLKNLRE，L*（13C6，15N）同位素標(biāo)記亮氨酸，分子量3 403.02Da，純度≥95%。以上所有合成肽段均由上海吉爾生化有限公司提供。甲酸、乙腈（質(zhì)譜級(jí)），美國(guó)賽默飛世爾科技公司;氯化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷（分析純），美國(guó)Sigma Aldrich公司;胰蛋白酶（質(zhì)譜級(jí)），美國(guó)賽默飛世爾科技公司;實(shí)驗(yàn)用水均由純水機(jī)（Milli-Q，Integral3）制備，電阻率為18.2MΩ·cm。本研究使用的乳粉樣品采購(gòu)于北京地區(qū)物美連鎖超市、山姆會(huì)員店等正規(guī)商店;乳原料均采購(gòu)于淘寶網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)以及阿里巴巴采購(gòu)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)。

1.2?乳鐵蛋白的檢測(cè)

1.2.1?樣品處理?取1.000 0g乳粉樣品，使用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖溶液溶解，充分振蕩，60℃水浴1h，冷至室溫并定容至50mL。取200μL溶解樣品，加入200μL 0.1%Rapigest SF進(jìn)行加熱10min，80℃。冷卻后加入50μL 2μmol/L乳鐵蛋白同位素內(nèi)標(biāo)肽段（ALGFLRIPSKVDSAL*YLGSRYLTTLKNLRE）混勻，再向混合樣品中添加10μg的胰蛋白酶，在37℃下溫浴，過(guò)夜酶解（16～24h）。次日使用2μL10%甲酸溶液停止酶解反應(yīng)，加水定容至1mL，15℃下10 000r/min離心10min，取上清液作為樣品待測(cè)液。

1.2.2?分析檢測(cè)條件?色譜條件：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3 C18親水柱（2.1mm×100mm，1.8μm）;流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈;梯度洗脫：0～0.5min，5%B、0.5～4.5min，5%B～50%B、4.5～4.6min，50%B～75%B、4.6～6.6min，75%B、6.6～6.7min，75%B～5%B、6.7～9.0min，5%B;流速：0.3mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：5μL。

質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧正離子模式（ESI+）;掃描模式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;毛細(xì)管電壓：3.5kV;錐孔電壓：10V;離子源溫度：150℃;偏轉(zhuǎn)電壓：50V;錐孔氣流量：150L/h;脫溶劑氣溫度：500℃;脫溶劑氣流量：800L/h;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。乳鐵蛋白特異肽段VDSALYLGSR配制成的定量標(biāo)曲線性范圍為1.25～100nmol/L，向各標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加的同位素特異肽段VDSAL*YLGSR的濃度為100nmol/L。圖1分別為乳鐵蛋白特異肽段和同位素特異肽段的質(zhì)譜提取離子流圖，在3.40min兩種肽段可以被徹底的分離和提取，該液相方法洗脫方法可以滿足質(zhì)譜定量的峰形要求。

2?結(jié)果與分析

2.1?乳粉原料國(guó)內(nèi)外含量分析

大宗乳粉原料在食品加工行業(yè)內(nèi)應(yīng)用廣泛，可用于制作奶味糖果、含乳飲料、咖啡伴侶、奶味零食、自制火鍋底料等，由于被當(dāng)作添加的食品輔料，其營(yíng)養(yǎng)成分從未被關(guān)注過(guò)，但在終產(chǎn)品的包裝上仍夸大含乳成分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前，在市面上普遍進(jìn)口乳粉原料的產(chǎn)地集中在新西蘭和波蘭，從表2、圖2可看出，乳業(yè)大國(guó)——新西蘭（恒天然）的乳粉原料中LF含量從42.8～72.3mg/100g不等，差異明顯，且有50%的檢驗(yàn)批次含量都未達(dá)到總體分析的平均值63.0mg/100g。波蘭的乳原料聲稱為乳清粉，但最終測(cè)定含量?jī)H為44.0mg/100g。反之，觀察中國(guó)產(chǎn)出的乳粉原料覆蓋東北、山東、江蘇、內(nèi)蒙古幾個(gè)產(chǎn)奶大省，除內(nèi)蒙古外，其余原料乳粉中LF含量豐富，均優(yōu)于國(guó)外同類產(chǎn)品，并高于本次分析總樣本的平均值。

2.2?乳制品國(guó)內(nèi)外含量分析

中國(guó)國(guó)內(nèi)的乳粉和液體乳市場(chǎng)經(jīng)本次調(diào)查后的檢驗(yàn)結(jié)果較為理想，涉及到10個(gè)國(guó)產(chǎn)大中型企業(yè)品牌的產(chǎn)品，乳粉產(chǎn)品主要集中在嬰幼兒配方乳粉和不同類型的營(yíng)養(yǎng)乳粉，液體乳覆蓋了全類型的乳飲品，兒童奶、早餐奶、復(fù)合營(yíng)養(yǎng)奶、無(wú)乳糖奶、強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)蛋白奶等。結(jié)果反映出了相關(guān)原料的2個(gè)問(wèn)題，一是不同廠商的嬰幼兒配方乳粉中LF含量差異較明顯，品牌10和品牌1的一段嬰幼兒乳粉相差了12倍之多，圖3中也明顯看出品牌10的LF含量遠(yuǎn)高于其余6個(gè)品牌。二是企業(yè)內(nèi)部的不同類型乳粉產(chǎn)品的LF含量也差異懸殊，如表3中品牌1、7、9的產(chǎn)品都有此類情況出現(xiàn)。這可能是不同企業(yè)選購(gòu)的乳粉基粉來(lái)源不同，也或許是不同類型產(chǎn)品針對(duì)的消費(fèi)人群不同，采取了不同營(yíng)養(yǎng)配方的調(diào)配比例。但縱觀液體乳的檢測(cè)值來(lái)看，不同品牌以及品牌內(nèi)部的不同類型產(chǎn)品中LF含量比較均衡（表4、圖4），波動(dòng)范圍是6.1～9.6mg/100g。我國(guó)的成品乳粉與液態(tài)乳中LF含量的比例是7～8倍，平均值分別是58.6、8.1mg/100g。

將中國(guó)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的數(shù)據(jù)與國(guó)外產(chǎn)品數(shù)據(jù)進(jìn)行橫向比較后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于調(diào)制乳粉而言，本次樣本量的LF平均值為54.6mg/100g，中國(guó)產(chǎn)乳粉的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量位居國(guó)際水平的第三名且含量高于平均值。但與前兩名瑞士和新西蘭的乳粉產(chǎn)品的LF含量還是有一定的差距（圖5）。愛爾蘭、荷蘭、丹麥乳粉產(chǎn)品的總體情況較低，低于平均值50%～77%。國(guó)外市場(chǎng)與我國(guó)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)出現(xiàn)的現(xiàn)象相似，同一國(guó)家的產(chǎn)品LF含量差異大，例如新西蘭、愛爾蘭、荷蘭的產(chǎn)品（表5）。再觀測(cè)液體乳產(chǎn)品情況，也與我國(guó)市場(chǎng)大致相同，產(chǎn)品間、產(chǎn)區(qū)間波動(dòng)不大，LF含量平均值為6.4mg/100g（表6）。本次分析的產(chǎn)品產(chǎn)地中78%的國(guó)家都高于平均值，中國(guó)的液體乳產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量較高，位居第二（圖6）。新西蘭、韓國(guó)的液體乳產(chǎn)品間LF的含量差異較明顯，并且含量較低。

3?討論

從本次分析結(jié)果來(lái)看，國(guó)際公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)奶源地與高LF含量的結(jié)果有所出入，不排除以下可能性：產(chǎn)品批次間存在差異，并非長(zhǎng)期使用固定奶源;不同品牌的生產(chǎn)工藝對(duì)營(yíng)養(yǎng)性蛋白有影響;劣質(zhì)過(guò)期或經(jīng)抽提乳粉經(jīng)過(guò)重新包裝，再次銷售;不同地域奶源質(zhì)量批次間差異較大等。目前，國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)GB 14880—2012食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)[18]中規(guī)定調(diào)制乳、風(fēng)味發(fā)酵乳、含乳飲料中的LF的含量不得高于100mg/100g。以此標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)判本次分析樣本質(zhì)量，國(guó)產(chǎn)乳粉、液體乳以及大宗乳粉原料均為合格產(chǎn)品。但從另一方面考慮，此標(biāo)準(zhǔn)并未定義LF的最低含量，由此引起的食品營(yíng)養(yǎng)成分缺失、食品真實(shí)性問(wèn)題、乳粉制造商的經(jīng)濟(jì)成本與宣傳的產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不一致等問(wèn)題日漸凸顯。本次重點(diǎn)分析調(diào)制粉的產(chǎn)品類型為嬰幼兒配方乳粉，也可觀察出國(guó)內(nèi)外產(chǎn)品均出現(xiàn)了LF含量高低分布不均的趨勢(shì)。如國(guó)內(nèi)嬰幼兒配方乳粉中LF含量最低值為品牌1（7.7mg/100g），最高值為品牌10（95.0mg/100g）;國(guó)外最低值產(chǎn)于愛爾蘭（12.7mg/100g），最高值產(chǎn)于瑞士（90.0mg/100g）。優(yōu)劣產(chǎn)品間的LF含量有9～10倍的差距。

另一方面，規(guī)定及制定LF最低限量值，需結(jié)合參考人乳和牛乳中該成分的正常含量和兒童、成人的日常營(yíng)養(yǎng)需求。據(jù)部分文獻(xiàn)報(bào)道，分娩后3個(gè)月內(nèi)母乳中LF含量大致在220～245mg/100mL，4個(gè)月后降至為102mg/100mL[19];牛初乳中的LF含量一般為150mg/100mL，牛常乳的含量則僅有10mg/100mL[20]。所以無(wú)論是人乳和牛乳的初乳中均含有高濃度的LF，而成熟乳中的乳糖和脂肪含量升高導(dǎo)致LF含量下降。因此，建議對(duì)嬰幼兒配方乳粉的LF補(bǔ)充量按照不同哺乳時(shí)期進(jìn)行限定，分階段制定配方乳粉中的補(bǔ)充含量范圍。從本次分析的情況來(lái)看，1段嬰幼兒配方乳粉中LF含量的平均值只有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求上限值的一半，其中只有1批次進(jìn)口荷蘭乳粉品牌聲稱添加較高含量的LF，測(cè)定值為500.3mg/100g，與其標(biāo)示值相符（數(shù)據(jù)未在列表中，避免使平均值偏離）。

4?結(jié)論

由于營(yíng)養(yǎng)活性的不可替代性，LF在當(dāng)今乃至未來(lái)的乳制品市場(chǎng)上會(huì)持續(xù)備受關(guān)注。從本次研究結(jié)論可以得出與普通消費(fèi)者印象中不相符的結(jié)果，并非全部進(jìn)口原料乳粉、調(diào)制乳粉以及液態(tài)乳的營(yíng)養(yǎng)成分含量高于國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品。因?yàn)槲覈?guó)也擁有極其優(yōu)質(zhì)的奶源帶區(qū)域，生產(chǎn)、運(yùn)輸、加工成本遠(yuǎn)低于國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品，其LF含量經(jīng)分析位于全球前列，應(yīng)成為我國(guó)消費(fèi)者的首選。相關(guān)市場(chǎng)監(jiān)管部門應(yīng)進(jìn)行調(diào)研后，制定出LF在不同類型產(chǎn)品中的最低限量，既能保障乳制品基本營(yíng)養(yǎng)成分的缺失、造假問(wèn)題，也可以維護(hù)市場(chǎng)同類產(chǎn)品價(jià)格懸殊的亂象。

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（責(zé)任編輯?唐建敏）