采用2，2'-偶氮二（2-脒基丙烷）二鹽酸（AAPH）在有氧條件下熱分解產(chǎn)生過(guò)氧自由基，代表脂肪氧合酶誘導(dǎo)多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，研究過(guò)氧自由基氧化對(duì)富硒大豆蛋白溶解性的影響。隨著 AAPH 添加濃度的增大，大豆蛋白溶解性含量下降。

富硒;大豆分離蛋白;過(guò)氧自由基;功能性質(zhì)

硒是人體必需的微量元素，以硒代氨基酸的形式存在于蛋白質(zhì)中作為硒酶的活性中心發(fā)揮作用，其生物功能主要是抗氧化。研究表明，硒元素可以顯著地提高富硒植物蛋白質(zhì)組分的抗氧化活性，如富硒綠茶、富硒大米、富硒大蒜等。另外，江西豐城被譽(yù)為“中國(guó)生態(tài)硒谷”，土壤中硒元素平均含量為0.28 μg/g，為硒蛋白的研究提供了得天獨(dú)厚的條件。由于硒與人體健康具有十分密切的關(guān)系，所以硒蛋白的研究有著重要的理論和實(shí)際意義。Chan等研究發(fā)現(xiàn)，富硒大豆中多達(dá)82%的硒是以SeMet和SeCys為主的高分子質(zhì)量形態(tài)存在，蛋白含量達(dá)35-40%，可大量富集硒，總硒含量達(dá)0.13 μg/g，是普通不富硒大豆的200多倍，此外，大豆是世界上最重要的食品原料，可直接食用或用來(lái)生產(chǎn)植物油、豆?jié){、嬰兒配方食品、豆腐、大豆粉等，所以富硒大豆具有作為新型富硒產(chǎn)品的天然優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒大豆，江西豐城富硒基地，普通大豆（平均硒含量～ 0.017 μg/g），市售;2，2'–鹽酸脒基丙烷（AAPH）、5，5'二硫代二硝基苯甲酸鹽（DNTB）、1-苯氨基萘-8-磺酸（ANS）、過(guò)硫酸銨、β-巰基乙醇，美國(guó)Sigma公司;石油醚（沸程60-90 ℃）等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器及設(shè)備

RH-basic 1磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司;LXJ-IIB離心機(jī)，海安亭科學(xué)儀器廠;SPX-250電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司;FreeZone 12-Plus冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司;新世紀(jì)T6紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司;Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Nicolet公司

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆脫脂粉末的制備

新鮮粉碎好的富硒和普通大豆中分別加入五倍體積的石油醚，室溫下攪拌脫脂4 h，重復(fù)五次，靜置沉淀，上清液回收，沉淀物置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干。收集干燥脫脂大豆過(guò)80目篩的細(xì)粉于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 大豆分離蛋白（SPI）制備

大豆分離蛋白的制備根據(jù)袁等人的堿提酸沉法并稍作改動(dòng)，具體過(guò)程為：脫脂大豆粉末按1：10的料液比加水?dāng)嚢?，? mol/L NaOH調(diào)pH至8.0，室溫下低速攪拌2 h，離心（8000 g，20 min，4 ℃），殘?jiān)貜?fù)提取，取上清液用1 mol/L HCl調(diào)pH至4.5，靜置0.5 h后再次離心（5000 g，20 min，4 ℃），充分棄去上清液，沉淀水洗兩次后，加水并用1 mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，加少許水經(jīng)攪拌溶解后，在4 ℃下對(duì)水透析24 h，每6 h更換水一次，經(jīng)冷凍干燥后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 過(guò)氧自由基氧化大豆蛋白制備

過(guò)氧自由基氧化大豆蛋白的制備方法如下：將制得大豆蛋白溶于0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液，蛋白濃度為 10 mg/mL，其中含有 0.5 mg/mL NaN3。將一定質(zhì)量 AAPH 溶解于大豆蛋白溶液，使AAPH 終濃度分別為 0、0.04、0.2、1、5 、25及 125 mmol/L，在 37 ℃避光條件下將混合液在恒溫振蕩水浴器中中速振蕩反應(yīng) 24 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液置于冰浴中使之溫度迅速降至 4 ℃以下，隨后將反應(yīng)液在 4 ℃條件下 15900 g 離心 1 h，移除少量冷卻過(guò)程中出現(xiàn)不溶物質(zhì)（非蛋白質(zhì)沉淀）。最后將反應(yīng)液在 4 ℃去離子水中透析 72 h，以除去殘余未反應(yīng) AAPH，透析過(guò)程中每隔6 h更換一次去離子水，最后冷凍干燥得到過(guò)氧自由基氧化大豆蛋白，并置于 4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 溶解性

蛋白質(zhì)溶解性的測(cè)定根據(jù)Bera & Mukherjee報(bào)道的方法，稍作改動(dòng)。稱(chēng)取0.25 g樣品溶于25 mL去離子水中，攪拌30 min，1 mol/L HCI或1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值7.0，再攪拌30 min，常溫下離心（5000 g，15 min）。取適量上清液稀釋后，福林酚法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧自由基氧化對(duì)大豆蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質(zhì)其他功能特性的基礎(chǔ)，溶解度可簡(jiǎn)單地用來(lái)表征氧化大豆蛋白聚集和變性程度，過(guò)氧自由基氧化修飾對(duì)大豆蛋白溶解性影響如圖1所示。從圖可見(jiàn)，SPI溶解度隨 AAPH 濃度增大而緩慢降低。這是由于低濃度 AAPH 氧化使大豆蛋白主要形成可溶性蛋白聚集體;但隨蛋白質(zhì)氧化程度增大，共價(jià)交聯(lián)使可溶性蛋白聚集體進(jìn)一步發(fā)生聚集，最終形成不可溶聚集體，導(dǎo)致氧化大豆蛋白溶解性下降。氧化過(guò)程中，相同濃度AAPH處理時(shí)SSPI的溶解度始終高于OSPI，再次說(shuō)明可能是硒元素的抗氧化活性為SPI起到了一定的保護(hù)作用。

3 結(jié)論

以實(shí)驗(yàn)室自制低氧化程度富硒大豆蛋白為原料，通過(guò)不同濃度 AAPH 熱降解形成過(guò)氧自由基氧化修飾得到不同氧化程度富硒大豆蛋白，研究過(guò)氧自由基氧化對(duì)富硒大豆蛋白溶解性的影響。研究表明，隨 AAPH 添加濃度升高，大豆蛋白溶解性含量下降。

參考文獻(xiàn)

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[2] Liu，K.，Y.Zhao，F(xiàn).Chen，et al.Purification，identification，an d in vitro antioxidant activities of selenium- containing proteins fromselenium - enriched brown rice [J].European Food Research and Technology ，2012，234： 61-68.

作者簡(jiǎn)介：范婷（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食油脂及植物蛋白工程。