唐 娜，周 略*，袁 健 （. 南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院、暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院、深圳市人民醫(yī)院，廣東深圳 58020；2. 廣東藥科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)系，廣東廣州 50006）

結(jié)直腸癌居全世界惡性腫瘤發(fā)病率及病死率的第3位[1-4]。Prohibitin(PHB)隸屬于SPFH家族，維持線粒體蛋白的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、增生、轉(zhuǎn)錄及凋亡等生物學(xué)功能，在腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)揮重要作用[5-11]。本研究主要運(yùn)用免疫組化方法觀察PHB在人結(jié)直腸癌標(biāo)本中的表達(dá)，研究其與患者性別、年齡、部位、分期、預(yù)后等的關(guān)系，為更好評(píng)估預(yù)后、尋找新治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床材料

2001年1月至2005年12月南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院臨床確診的結(jié)直腸癌，蠟塊400例。入組標(biāo)準(zhǔn)：所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。收集患者相關(guān)的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小及部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、分化程度和臨床分期(參照美國(guó)《AJCC癌癥分期手冊(cè)》第7版)，并附完整的隨訪資料(0～132個(gè)月)。對(duì)其中的388例標(biāo)本進(jìn)行CD31免疫組化檢測(cè)，分析有無(wú)血管侵犯。

1.2 方法

標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋的結(jié)直腸癌組織蠟塊，連續(xù)切片，片厚2 μm，常規(guī)HE染色。操作步驟按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中高壓修復(fù)加熱3 min進(jìn)行抗原修復(fù)，PHB一抗(1:500)、CD31一抗(1:100)室溫孵育60 min，試劑盒A液室溫孵育30 min，上述各步驟間用PBS洗片3次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡觀察。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。兔抗人PHB單克隆抗體購(gòu)自Eptomics公司；鼠抗人CD31單克隆抗體購(gòu)自中杉金橋公司；二步法抗兔/抗鼠通用性免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自基因公司。

1.3 結(jié)果判斷

陽(yáng)性結(jié)果判定以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色或棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師雙盲閱片，采取之前文獻(xiàn)的評(píng)估方法[12]，分別隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算不同表達(dá)強(qiáng)度癌細(xì)胞表達(dá)的百分率。陽(yáng)性強(qiáng)度就看胞質(zhì)染色的染色強(qiáng)度，陰性、淡黃色、黃色、棕褐色，分別標(biāo)記為陰性(－)、弱陽(yáng)性(+)、中度陽(yáng)性(++)和強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，分別乘以0、1、2、3，相加得到該病例的陽(yáng)性表達(dá)計(jì)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的比較用Pearson卡方檢驗(yàn)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果與患者術(shù)后生存時(shí)間的比較采用生存分析的Log-Rank檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHB在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

PHB在個(gè)別正常結(jié)腸腺體的基底部單個(gè)細(xì)胞表達(dá)，定位于細(xì)胞核內(nèi)，類似干細(xì)胞分布特征(圖1 A、B)。結(jié)直腸原發(fā)癌組織中僅少量癌細(xì)胞表達(dá)PHB，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的高分化腺癌，部分癌細(xì)胞腺腔緣表達(dá)PHB(朝向腺腔中心區(qū)域)，呈向心性表達(dá)方式(圖1 C)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者原發(fā)癌組織內(nèi)PHB呈離心性表達(dá)(朝向間質(zhì)區(qū)域)，表現(xiàn)為癌巢周邊部突出于癌性腺腔的個(gè)別癌細(xì)胞、侵入間質(zhì)的癌細(xì)胞和侵入脈管內(nèi)的癌細(xì)胞表達(dá)PHB(圖1 D～F)；PHB陽(yáng)性的癌細(xì)胞面對(duì)間質(zhì)區(qū)域細(xì)胞漿內(nèi)PHB強(qiáng)表達(dá)，而朝向癌巢中心區(qū)域細(xì)胞漿內(nèi)PHB弱表達(dá)(圖1 D)，PHB表達(dá)模式與癌組織侵襲的臨床標(biāo)本和癌組織侵犯血管的檢測(cè)證據(jù)(圖2、3)，浸潤(rùn)間質(zhì)的單個(gè)癌細(xì)胞、簇狀癌細(xì)胞與脈管內(nèi)浸潤(rùn)的癌細(xì)胞一側(cè)強(qiáng)表達(dá)PHB。

圖1 Prohibitin在結(jié)直腸正常黏膜與癌組織內(nèi)的表達(dá)

圖2 PHB表達(dá)模式與癌組織侵襲的臨床標(biāo)本檢測(cè)證據(jù)

圖3 PHB侵襲血管的臨床標(biāo)本檢測(cè)證據(jù)

2.2 免疫組化結(jié)果與患者臨床資料的關(guān)系分析

2.2.1 PHB表達(dá)與患者性別、年齡、分化程度、臨床分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征的關(guān)系 本組400例結(jié)直腸癌組織中，248例PHB呈陽(yáng)性表達(dá)，152例PHB呈陰性表達(dá)。不同性別、年齡(<60歲與≥60歲)、腫瘤分化程度、腫瘤大小(<4 cm與≥4 cm)、臨床分期、有/無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PHB蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同腫瘤部位(結(jié)腸、直腸)及有或無(wú)血管侵犯患者PHB蛋白表達(dá)的差異則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 PHB蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系 (例)

接上表

2.2.2 PHB蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系 應(yīng)用Log-Rank生存分析法分析PHB蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時(shí)間，PHB陽(yáng)性與陰性的患者中位生存期分別為90.9和87.7個(gè)月，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.3 PHB向心性分布、離心性分布與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系 PHB陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中，呈離心性表達(dá)84例，呈向心性表達(dá)164例，離心性分布較向心性分布患者中位生存時(shí)間短，分別為64.1個(gè)月和108.6個(gè)月，PHB向心性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者中位生存期明顯長(zhǎng)于離心性表達(dá)方式的患者(P<0.01)。

圖4 結(jié)直腸癌PHB表達(dá)方式臨床隨訪分析

3 討論

PHB與腫瘤發(fā)生、增殖與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性不同研究結(jié)論不同。大多數(shù)研究認(rèn)為Ras激活后，與定位于細(xì)胞質(zhì)膜下的PHB直接結(jié)合，導(dǎo)致C-Raf激活，Ras-Raf途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和遷移，在宮頸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、前列腺癌、鼻咽癌和卵巢癌中PHB高表達(dá)[5-6,13-16]；另有研究認(rèn)為PHB阻止細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變，阻斷細(xì)胞轉(zhuǎn)錄而抑制癌細(xì)胞增殖[5]。高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系PHB表達(dá)明顯增強(qiáng)，癌細(xì)胞遷移能力顯著增高[17]，Ras-Raf激活誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，依賴于PHB的介導(dǎo)[18-19]。

本研究顯示，PHB在正常結(jié)腸黏膜腺體與間質(zhì)內(nèi)幾乎不表達(dá)，僅在個(gè)別患者正常結(jié)腸腺體的基底部見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞表達(dá)，定位于細(xì)胞核內(nèi)，與正常干細(xì)胞數(shù)量和分布位置類似。結(jié)直腸原發(fā)癌中發(fā)現(xiàn)僅有少量癌細(xì)胞表達(dá)(與CSC占腫瘤細(xì)胞群的1/1000～1/100相一致)PHB，而朝向癌巢中心區(qū)域細(xì)胞漿內(nèi)PHB弱表達(dá)，癌巢周邊部突出于癌性腺腔的個(gè)別癌細(xì)胞、侵入間質(zhì)的癌細(xì)胞和侵入脈管內(nèi)的癌細(xì)胞表達(dá)PHB，表明PHB的表達(dá)與癌細(xì)胞將要逃離原發(fā)灶和侵襲行為有關(guān)。PHB在結(jié)直腸癌組織內(nèi)表達(dá)具有向心性與離心性兩種表達(dá)方式，且在同一細(xì)胞內(nèi)呈極性表達(dá)，提示PHB參與CSC的增殖分化和遷移的調(diào)節(jié)，PHB表達(dá)區(qū)域可能促進(jìn)CSC遷移相關(guān)的前導(dǎo)緣形成。更有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)間質(zhì)的單個(gè)癌細(xì)胞、簇狀癌細(xì)胞與脈管內(nèi)浸潤(rùn)的癌細(xì)胞一側(cè)強(qiáng)表達(dá)PHB，提示PHB誘導(dǎo)遷移癌細(xì)胞的細(xì)胞骨架形成，細(xì)胞外基質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞可能對(duì)遷移癌細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用。這些結(jié)果提示，PHB在結(jié)直腸癌癌細(xì)胞遷移過(guò)程中起重要作用。

本文結(jié)果顯示，不同性別、年齡(<60歲與≥60歲)、腫瘤分化程度、腫瘤大小(<4 cm與≥4 cm)、臨床分期、有/無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PHB蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同腫瘤部位(結(jié)腸、直腸)及有/無(wú)血管侵犯患者PHB蛋白表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)。PHB向心性與離心性的兩種表達(dá)模式與患者預(yù)后密切相關(guān)，離心性表達(dá)者預(yù)后明顯差于向心性表達(dá)者(P<0.001)。

綜上所述，PHB的表達(dá)模式可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)，PHB離心性表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良特征之一。這些發(fā)現(xiàn)為PHB在結(jié)直腸癌中轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用提供了新方向，其相關(guān)分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。