張 威，馬志斌，羊軼駒

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內科，黑龍江哈爾濱 150000；2. 海南省儋州市人民醫(yī)院，海南儋州 571700)

結直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。Global Cancer Statistics 2018統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年，全球結直腸癌新發(fā)病例超過1 800 000，且死亡患者數(shù)881 000例，約占據(jù)全球惡性腫瘤的1/10[1]。結直腸癌發(fā)病率位居全球第3位，死亡率位居全球第2位。在地域分布上，結直腸癌主要分布于高人類發(fā)展指數(shù)地區(qū)，如北美和西歐。但近年來，受飲食模式改變、肥胖人口增加、生活方式改變及經(jīng)濟發(fā)展等影響，結直腸癌分布上顯示出在發(fā)展中國家發(fā)病率顯著提高的這一新趨勢[2-3]。目前，結直腸癌的主要臨床治療手段為手術治療輔以放化療，但半數(shù)以上患者容易復發(fā)及轉移。因而，闡明結直腸癌的發(fā)病機制、尋找其生物學標記物對于結直腸癌的診治、降低其病死率尤為重要。現(xiàn)有研究證實，結直腸癌的發(fā)生發(fā)展與miRNA相關聯(lián)[4]。

2002年，CALIN等[5]指出，miRNA-15與miRNA-16在慢性淋巴細胞白血病細胞中表達缺失，從此對miRNA在腫瘤中作用的研究不斷深入。miRNA作為一類細胞內源性非編碼類小RNA，基于堿基互補配對原則與目標mRNA配對，導致mRNA失去穩(wěn)定性、降解、翻譯抑制，甚至直接清除，由此miRNA調節(jié)原癌基因與抑癌基因的表達，影響腫瘤的發(fā)生及進展?，F(xiàn)有研究證實，miRNA-429參與結直腸癌發(fā)生及進展過程，也有研究提示，其與在腫瘤發(fā)展過程中扮演重要角色的SIAH1存在靶向關系。本文主要對miRNA-429及作用靶點SIAH1在結直腸癌中的作用進行總結概括。

1 miRNA-429的結構與功能

miRNA-429是一類非編碼類內源性單鏈小RNAs，其長度為20～25個核苷酸，編碼基因位于1號染色體。miRNA-429的種子序列為AAUACUG，決定了miRNA與目標mRNA的結合位點。miRNA-429作為一類RNAs，通過下述一系列步驟生成并發(fā)揮作用：首先，在細胞核內，miRNAs編碼基因在RNA多聚酶Ⅱ作用下轉錄生成primary miRNAs(pri-miRNAs)；其次，pri-miRNAs在細胞核內由Dorsha及DGCR8等核心組成的微處理器復合物加工，生成precursor miRNAs(pre-miRNAs)；再次，pre-miRNAs以膜輸出蛋白-5為載體轉運至細胞質；最后，核糖核酸酶DICER剪切pre-miRNAs。至此，miRNAs形成[6]。在細胞質中，向導股miRNAs載入核心Argonaute proteins(AGO)蛋白及附屬蛋白構成miRNA induced silencing complex(miRISC)。MiRISC基于序列互補配對原則與目標mRNA3′端非翻譯區(qū)配對結合。一旦配對結合，miRNA便通過抑制目標基因翻譯環(huán)節(jié)抑制相應蛋白生成,同時這一過程伴隨著mRNA脫腺苷化及mRNA的減少。通過上述調節(jié)機制，miRNA在多種細胞進程中發(fā)揮重要作用，如細胞增生、細胞周期調控、細胞凋亡、細胞分化及細胞侵襲，以及組織特異功能如免疫反應、激素釋放、血管生成等。

2 miRNA-429在結直腸癌中作用的研究

2.1 miRNA-429在結直腸癌發(fā)生過程中的作用癌的發(fā)生是正常細胞轉變?yōu)閻盒阅[瘤細胞的過程。不同于正常細胞，癌細胞具有兩大特性，即生長增殖不受控制，侵犯鄰近正常組織并轉移至遠處器官組織[7]。MO等[4]通過分析轉染miRNA-429與轉染anti-miRNA-429兩組結直腸癌細胞系Caco2細胞的凋亡，結果顯示，轉染miRNA-429的結直腸癌細胞凋亡增加，而轉染anti-miRNA-429的結直腸癌細胞凋亡減少，這提示miRNA-429促進結直腸癌細胞的凋亡。同時，MO等[4]通過分析轉染miRNA-429組或轉染anti-miRNA-429組結直腸癌細胞系Caco2細胞生存力，結果提示，相比于轉染anti-miRNA-429組，轉染miRNA-429組結直腸癌細胞生存力穩(wěn)定下降。此外，高表達的miRNA-429使結直腸癌細胞系SW480細胞聚集于細胞周期G1期，這提示miRNA-429表達阻滯了細胞的細胞周期進展。最后，MO等[4]發(fā)現(xiàn)，miRNA-429通過調節(jié)CHMP5介導的凋亡信號通路，實現(xiàn)對細胞增生、凋亡及細胞周期進展等過程調節(jié)。SUN等[8]通過實時熒光定量PCR測定結直腸癌組織細胞miRNA-429的表達，結果顯示，相比鄰近正常組織，Ⅱ期及Ⅲ期結直腸癌組織細胞內的miRNA-429表達下調；同時增強結直腸癌細胞系(SW620,SW480和HT-29)內miRNA-429的表達，抑制結直腸癌細胞的增生。SW620結直腸癌細胞系構建的裸鼠異種移植物動物模型證實，miRNA-429可以抑制體內結直腸癌腫瘤的生長。SUN等[8]提出miRNA-429通過靶向調節(jié)轉錄因子Onecut2影響結直腸癌發(fā)生。因此，miRNA-429抑制結直腸癌的發(fā)生，可以作為抑制結直腸癌發(fā)生的有力因子。

2.2 miRNA-429在結直腸癌轉移過程中的作用

2.2.1miRNA-429在結直腸癌細胞遷移及浸潤過程中的作用 腫瘤轉移是腫瘤細胞由初始部位遷移至遠處器官并形成轉移瘤[9-10]。SUN等[8]通過細胞劃痕實驗檢測miRNA-429對結直腸癌細胞活動性的影響，結果顯示，增強miRNA-429表達下調了結直腸癌細胞的遷移能力；同樣，通過細胞侵襲實驗檢測miRNA-429對結直腸癌細胞浸潤能力的影響，結果顯示，超表達miRNA-429抑制結直腸癌細胞的浸潤能力。SiRNA干擾實驗進一步證實miRNA-429通過靶向調節(jié)轉錄因子Onecut2抑制結直腸癌細胞的遷移及浸潤。TIAN等[11]上調結直腸癌細胞miRNA-429表達，結果顯示，超表達miRNA-429抑制結直腸癌細胞遷移及浸潤能力。隨后，TIAN等[11]發(fā)現(xiàn)，miRNA-429是通過負向調節(jié)PAK6/cofilin信號通路抑制結直腸癌細胞的遷移及入侵。

2.2.2miRNA-429在上皮-間質轉移中的作用 上皮-間質轉移，即正常具有極性的上皮細胞轉變成間質細胞，其主要標志為細胞極性缺失、細胞間粘附缺失、強化遷移能力等。經(jīng)過上皮-間質轉移，細胞獲得間質細胞特性并具有強化的遷移及浸潤能力。上皮-間質轉移的兩個主要的特性即上皮標記物如E-鈣黏素/細胞連接蛋白的缺失，間質標記物如N-鈣黏素/α-平滑肌肌動蛋白/ZEB1及ZEB2等的增加。SUN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-429通過調控Onecut2、Onecut2介導的上皮-間質轉移相關基因及轉錄激活物抑制結直腸癌細胞上皮-間質轉移的發(fā)生。通過上述機制，miRNA-429抑制結直腸癌細胞的上皮-間質轉移，繼而抑制了結直腸癌的轉移。

2.3 miRNA-429在結直腸癌中的作用現(xiàn)階段就miRNA-429對結直腸癌的作用尚存在爭議。少數(shù)研究報道，miRNA-429促進結直腸癌的發(fā)生及進展。2013年，LI等[12]通過檢測107對結直腸癌組織與相鄰正常組織的miRNA-429，結果提示，結直腸癌細胞內的miRNA-429表達上調，且同組實驗驗證超表達miRNA-429通過負向調控SOX2表達抑制結直腸癌細胞的凋亡。2017年，HAN等[13]檢測71對結直腸癌組織與鄰近正常組織的miRNA-429，結果顯示，結直腸癌組織細胞內miRNA-429表達上調,并證實miRNA-429抑制HOXA5表達并促進結直腸癌進展及轉移。同時，LI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，高表達miRNA-429患者對比低表達患者預后不良；HAN等[13]研究發(fā)現(xiàn)，高表達miRNA-429患者平均生存時間縮短，且與結直腸癌淋巴結轉移及腫瘤大小顯著相關。實驗使用的細胞系不同、結直腸癌腫瘤分期的差異以及實驗組織樣本的差異可能導致了與上述不同的結論，但仍傾向于miRNA-429抑制結直腸癌細胞的發(fā)生及發(fā)展。

3 SIAH1的結構、功能及在腫瘤中的作用

3.1 SIAH1的結構、功能SIAH1即E3泛素蛋白連接酶，其編碼基因位于染色體16q12.1，在人類細胞內，SIAH1與SIAH2蛋白互為同源體，且兩者在進化過程中間保持高度一致性。在結構上，SIAH1包含4個結構域：the really interesting new gene (RING) domain、the SIAH-type zinc finger (SZF) domain、the substrate-binding site (SBS)、the dimerization domain (DIMER)[14]。RING domain是E3連接酶的催化活性位點；基質結合域由SZF域、SBS域及DIMER域構成，負責基質識別、靶向作用、關聯(lián)及降解退化[15]。SIAH1作為E3泛素連接酶，通過干擾、修飾基質，統(tǒng)籌泛素介導的蛋白降解，調節(jié)蛋白穩(wěn)定性，負責蛋白復合物的組裝和蛋白亞細胞內定位等[16]。

3.2 SIAH1在結直腸癌及相關腫瘤中的作用SANDRA等[17]通過分析干擾SIAH1蛋白對結直腸癌細胞增殖的影響，結果顯示，SIAH1減少導致結直腸癌細胞內致癌因子β-catenin的升高，而超表達SIAH1導致細胞內β-catenin下降，提示SIAH1促進β-catenin的降解。而β-catenin已被證實促進多種原癌基因的表達，并被認為是促進結直腸癌發(fā)生及進展的重要因素[18-19]。在同一實驗中敲除SIAH1基因可導致原癌基因c-MYC的增加[20]。這些提示SIAH1抑制結直腸癌的發(fā)生及進展。同樣，在胃癌[21]、白血病[22]、乳腺癌[23]及神經(jīng)膠質瘤[24]等腫瘤研究中，均提示SIAH1為抑癌因子。WONG等[25]對以往SIAH1在腫瘤中的作用作總結，也傾向于SIAH1為抑癌因子。但在肝癌這一腫瘤類型中，SIAH1被證實是原癌因子，起促進腫瘤的作用。BRAUCKHOFF等[26]檢測正常肝臟組織、癌前病變肝組織及肝癌組織細胞內SIAH1蛋白并作對比，結果顯示，對比于非腫瘤肝細胞，SIAH1在肝癌細胞核內顯著蓄積。進一步運用特異siRNA干擾SIAH1基因表達并分析對肝癌細胞增生及遷移的影響，結果提示，肝癌細胞核SIAH1下調導致肝癌細胞的生存力及遷移能力下降；超表達的SIAH1引起肝癌細胞生存力中等程度地提高，提示SIAH1促進肝癌細胞的增生及轉移。值得注意的是，通常在肝癌細胞SIAH1是下調的。我們認為，SIAH1在細胞內的表達是一個動態(tài)過程，且SIAH1在細胞內的亞定位影響其與基質結合，影響其在腫瘤中的作用?，F(xiàn)階段關于SIAH1在結直腸癌中的研究尚少，難以就其促進或抑制結直腸癌下結論，仍需不斷探索。

4 MiRNA-429、SIAH1在腫瘤中的作用

現(xiàn)階段，有很多關于miRNA靶向作用SIAH1并影響腫瘤進展的研究。JIANG等[27]證實，敲除miRNA-299-5p可以靶向作用SIAH1并抑制肝細胞癌的進展。ZHANG等[28]發(fā)現(xiàn)，miRNA-107可以靶向控制SIAH1并促進乳腺癌細胞的增生及進展。FLORES等[29]證明，miR-994靶向作用于SIAH1并抑制乳腺癌細胞的增生及轉移。在結直腸癌這一腫瘤類型中，目前尚無miRNA-429與SIAH1在結直腸癌中作用的研究，但由馬志斌副教授主持的課題組，通過生物信息學數(shù)據(jù)庫Target scan，在線分析預測miR-429特異性靶基因，結果顯示，miRNA-429可以靶向作用SIAH1的3′-UTR區(qū)。為證實這一假設，該課題組運用雙熒光素酶實驗檢測miRNA-429對SIAH1的靶向調控，結果顯示，SIAH1基因的3′-UTR區(qū)有miRNA-429的特異性結合位點，且后續(xù)細胞學實驗證實，miRNA-429抑制SIAH1表達(圖1)，同時，miRNA-429靶向調控SIAH1影響結直腸癌細胞增殖(相關研究結果正在發(fā)表中)。

圖1 miR-429負性調控SIAH1蛋白的表達

Fig.1 miR-429 negatively regulated the expression of SIAH1

5 前景和展望

近年來，結直腸癌的發(fā)病率不斷攀升，對人類的健康造成巨大威脅?，F(xiàn)階段，結直腸癌治療面臨的主要難題是早期診斷和晚期治療。與正常組織相比，結直腸癌病變組織中miRNA-429表達差異有統(tǒng)計學意義，使其具有成為結直腸癌的生物學標記物潛力，并為結直腸癌的診斷提供幫助。隨著生物治療在晚期結直腸癌治療中的應用，晚期結直腸癌患者總生存時間得到延長。miRNA-429對結直腸癌的發(fā)生、轉移過程的諸多環(huán)節(jié)發(fā)揮重要調節(jié)作用，可以為生物治療提供新的目標，并據(jù)此開發(fā)相應的生物治療方案。同時，miRNA-429表達與結直腸癌淋巴結轉移及腫瘤大小的相關性，對患者預后的相關性對治療方案的制訂具有一定的價值。

已有學者提出將SIAH1作為抗癌治療的新靶點，且已經(jīng)在肺癌及胰腺癌的細胞模型及動物模型中得以實現(xiàn)[30]。目前，干預SIAH1表達主要3個位點：①首先是SBD域及SIAH-SIAH間二聚化結構域。Phyllopod(PHYL)可以阻滯SBD域，減弱腫瘤細胞增生及轉移擴散，但由于SIAH間SBD結構域保持者高度同源，基于PHYL開發(fā)SIAH1特異性藥物將很困難[31]。②SIAH蛋白RING結構域的 N末端。干預RING域可以修復Ras信號通路并阻礙腫瘤進展。SIAH1與SIAH2的N末端不同，這讓SIAH特異性阻滯劑成為可能。但干預RING域并未修復SIAH蛋白通過SBD或SIAH1/SIAH2異二聚體結合基質蛋白的能力。③SIAH單體蛋白的二聚化位點。但現(xiàn)階段基于上述3個位點干預SIAH1的表達較困難。實驗已經(jīng)證實，miRNA-429可以靶向抑制SIAH1影響結直腸癌細胞增殖，這將豐富SIAH1的調控機制，為開發(fā)SIAH1特異藥物及結直腸癌治療措施提供新的思路。