鐘 波，侯 偉，呂社民，王慧淵，耿 妍，楊旭東，薛 麗

(西安交通大學(xué)：1. 第二附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科，陜西西安 710004；2. 醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061；3. 第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710004)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是世界范圍內(nèi)一種常見的慢性呼吸道疾病，以氣道重塑為突出的病理學(xué)特征[1]。整體而言，哮喘是一種環(huán)境因素與易感基因共同作用的疾病，所涉及的易感基因達(dá)到一百余種[2]。盡管在遺傳學(xué)病因方面的研究已經(jīng)取得了明顯進(jìn)展，但有關(guān)哮喘易感基因的篩選與鑒定仍需進(jìn)一步研究[3]，篩選哮喘相關(guān)差異表達(dá)基因?qū)α私馄浒l(fā)病機(jī)制具有突出意義。因此，我們之前的研究在E3大鼠體內(nèi)使用雞卵清蛋白(ovalbumin, OVA)促使產(chǎn)生抗原誘導(dǎo)肺部炎癥(antigen induced pulmonary inflammation, AIPI)模型，通過抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了大鼠肺組織差異表達(dá)的cDNA文庫，篩選出1個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異基因，名為程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death 4, Pdcd4)，并確定其在E3大鼠AIPI模型中的表達(dá)水平升高[4]。為進(jìn)一步了解該基因的功能，本研究建立了Pdcd4基因的在體干擾大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑8～12周齡近交系E3大鼠32只，雌雄皆有，為西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系提供。OVA與鋁佐劑購自Sigma公司，Trizol購自 Invitrogen公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ購自TaKaRa公司，ELISA試劑盒購自Cell Signaling Technology公司，Pdcd4 shRNA質(zhì)粒購自上海吉瑪基因技術(shù)有限公司(Pdcd4 shRNA序列GCGGAGATGTTAAGGGATTTG，NC-shRNA序列GTTCTCCGAACGTGTCACGT)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建8～12周齡的E3大鼠32只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組各8只。所有大鼠均在第0天腹腔注射OVA/鋁佐劑的混懸液致敏；從第14天起，對(duì)照組大鼠用PBS雙側(cè)滴鼻，其余大鼠用1 mg/mL的OVA溶液雙側(cè)滴鼻攻擊，共持續(xù)1周，構(gòu)建AIPI模型；后分為3組，于第13天和第17天，各組分別鼻腔滴注50 μL(1 μg/μL)的Pdcd4 shRNA質(zhì)粒溶液(Pdcd4干擾組)、50 μL NC-shRNA質(zhì)粒溶液(無關(guān)質(zhì)粒組)及50 μL醫(yī)用注射用水(AIPI模型組)。

第21天時(shí)麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后，獲取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，離心后分別留取上清和細(xì)胞沉淀，取部分細(xì)胞用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余細(xì)胞用于檢測(cè)Pdcd4的mRNA表達(dá)；留取肺組織制作病理切片進(jìn)行相關(guān)染色。本研究經(jīng)過西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。模型構(gòu)建的具體流程如圖1所示。

圖1 大鼠在體干擾流程示意圖

Fig.1 Schematic diagram of rat RNAiinvivo

1.3 組織化學(xué)染色常規(guī)制作肺組織HE染色切片，顯微鏡下觀察氣道周圍炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。將炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況分為4個(gè)等級(jí)：0級(jí)，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；1級(jí)，氣道周圍有一層炎性細(xì)胞；2級(jí)，氣道周圍有兩層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；3級(jí)，氣道周圍有兩層以上炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。將切片上的每一個(gè)氣道計(jì)分，并把所有氣道的分值相加求平均值，以代表氣道炎癥的整體情況。

計(jì)數(shù)板上滴加20 μL BALF細(xì)胞懸液，顯微鏡下常規(guī)觀察并計(jì)BALF中總的細(xì)胞數(shù)。Wright-Giemsa染液處理BALF細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，每一張玻片上連續(xù)觀察200個(gè)細(xì)胞，分別記錄淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的數(shù)目。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)Pdcd4基因mRNA表達(dá)常規(guī)用Trizol提取BALF細(xì)胞中總RNA，按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。RT-qPCR檢測(cè)Pdcd4在體RNA干擾的效率，反應(yīng)體系：20倍稀釋的cDNA 4 μL、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 4 μL、Pdcd4上下游引物各0.5 μL，混勻、瞬時(shí)離心。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。GAPDH為內(nèi)參，各引物信息見表1。計(jì)算并比較基因相對(duì)表達(dá)水平。

表1 基因引物信息

Tab.1 Information of gene primers

基因名稱序列(5′～3′)Pdcd4AACTATGATGATGACCAGGAGAACGCTAAGGACACTGCCAACACGAPDHCGGCAAGTTCAACGGCACAGGAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC

1.5 常規(guī)ELISA檢測(cè)大鼠血清中的OVA特異性IgG將5 μg/mL的OVA溶液加入96孔板，4 ℃過夜。洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫后，每孔加入100 μL封閉液，37 ℃孵育1 h。洗脫緩沖液洗板3次。用1×PBS將血清稀釋100倍，每孔加入50 μL血清樣品，37 ℃孵育1 h。洗脫后用封閉液將1 μg/μL馬辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗大鼠λ/κ鏈抗體稀釋3 000倍，取50 μL加入各孔，37 ℃孵育1 h。洗脫后加入顯色劑TMB 100 μL，室溫避光孵育20 min。加入100 μL終止液，室溫避光10 min內(nèi)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度(A)值。

同樣用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中的總IgE，包被抗體為50 μL 2 μg/mL的小鼠抗大鼠IgE重鏈抗體，用1×PBS將血清稀釋1 000倍，其余步驟同OVA特異性IgG檢測(cè)。

1.6 血清一氧化氮的測(cè)定在鎘粒中加入5 mmol/L CuSO4使鎘粒活化，0.2 mol/L的甘氨酸緩沖液(pH 7.5)洗滌3次。在100 μL BALF上清中加入400 mg鉻粒，37 ℃下震蕩30 min，瞬時(shí)離心后吸取上清100 μL，加入等量Griess試劑，震蕩混勻，室溫孵育1 h，545 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值。將100、50、25、12.5、6.25 μmol/L的NaNO2各吸取100 μL，加入等量Griess試劑混勻，室溫孵育1 h，545 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值，擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出待測(cè)樣品中一氧化氮的含量。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織切片的HE染色與病理學(xué)計(jì)數(shù)結(jié)果與對(duì)照組相比，AIPI模型組、無關(guān)質(zhì)粒組及Pdcd4干擾組大鼠的HE染色顯示，肺組織切片中可見支氣管周圍及肺泡中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)支氣管周圍滲出的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，后3組的病理學(xué)計(jì)數(shù)值均較對(duì)照組明顯升高(圖2)，表明成功誘導(dǎo)肺部炎癥模型。但是，Pdcd4干擾組與無關(guān)質(zhì)粒組的病理學(xué)計(jì)數(shù)沒有差異，提示Pdcd4的在體干擾對(duì)于肺組織炎癥滲出沒有明顯影響。

2.2 BALF細(xì)胞中Pdcd4的mRNA表達(dá)變化RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Pdcd4 shRNA干擾組大鼠BALF細(xì)胞中Pdcd4的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(圖3)，提示大鼠Pdcd4基因干擾模型的構(gòu)建是成功的。

圖2 AIPI大鼠肺組織的病理學(xué)改變

Fig.2 Pathological changes of AIPI rat lung tissues

圖3 各組大鼠BALF細(xì)胞中Pdcd4 mRNA的表達(dá)變化

Fig.3 Pdcd4 mRNA expression of BALF cells of rats in groups

2.3 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別計(jì)數(shù)各組BALF中總細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，Pdcd4干擾組與無關(guān)質(zhì)粒組的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)有明顯差異，表明Pdcd4干擾可以減少肺泡嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。但兩組的總細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等計(jì)數(shù)沒有明顯差異(圖4)。

2.4 血清中一氧化氮、總IgE、OVA特異性IgG的檢測(cè)結(jié)果Pdcd4在體干擾后，大鼠血清一氧化氮、總IgE、OVA特異性IgG等指標(biāo)均沒有明顯變化(圖5)。

3 討 論

RNA干擾是一種由小分子雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，作用于轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平，抑制目的基因的表達(dá)[5]。RNA干擾技術(shù)現(xiàn)已在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[6]。本研究通過將Pdcd4的干擾質(zhì)粒滴入AIPI大鼠鼻腔，下調(diào)大鼠體內(nèi)Pdcd4的表達(dá)，構(gòu)建了大鼠Pdcd4基因的在體干擾模型，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

圖4 各組大鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果分析

*P<0.05。

圖5 血清一氧化氮(A)、總IgE(B)、OVA特異性IgG(C)的檢測(cè)結(jié)果

*P<0.05。

大鼠Pdcd4基因定位于1號(hào)染色體，小鼠定位于19號(hào)染色體，人類染色體定位于10號(hào)染色體，DNA全長(zhǎng)為26.9 kb，含13個(gè)外顯子，cDNA全長(zhǎng)約3.5 kb，其中編碼區(qū)約1.4 kb，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量51.6 ku，共含469個(gè)氨基酸[6-7]。該基因最初是在凋亡發(fā)生時(shí)篩選出的上調(diào)基因，其表達(dá)產(chǎn)物通過抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)節(jié)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，作用于細(xì)胞周期，從而對(duì)細(xì)胞的程序性死亡發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，抑制腫瘤生成[8-9]。

近年來發(fā)現(xiàn)Pdcd4也參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。ASUDA等[10]發(fā)現(xiàn)LPS抑制小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中Pdcd4 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)。同時(shí)，研究表明Pdcd4不僅受炎癥因子的調(diào)節(jié)，同時(shí)其本身也可以調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生。通過siRNA技術(shù)下調(diào)RAW264.7細(xì)胞中Pdcd的表達(dá)，可以明顯加強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的TNF-α蛋白的產(chǎn)生，提高IFN-γ、CCL1、CCL20和IL-10等分子在mRNA的表達(dá)，表明Pdcd4可以抑制以上這些炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，Pdcd4基因敲除小鼠的淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，但可抑制炎癥反應(yīng)的因子，導(dǎo)致小鼠淋巴瘤發(fā)病率明顯升高，但對(duì)炎癥性疾病如自身免疫性腦脊髓炎和糖尿病則出現(xiàn)明顯的抵抗[11]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，Pdcd基因啟動(dòng)子的多態(tài)性與兒童哮喘的嚴(yán)重程度存在相關(guān)性[12]，進(jìn)一步表明深入了解Pdcd4對(duì)于哮喘發(fā)病機(jī)制的研究意義。哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞之一為嗜酸性粒細(xì)胞，該細(xì)胞可以合成并分泌堿基蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化酶等物質(zhì)，對(duì)氣道上皮組織和肺組織產(chǎn)生損傷，進(jìn)而使機(jī)體表現(xiàn)出氣道高反應(yīng)性；另外，嗜酸性粒細(xì)胞可以影響哮喘氣道神經(jīng)的反應(yīng)性，從而使該細(xì)胞在哮喘氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13]。本研究結(jié)果表明，Pdcd4的在體干擾可以減少AIPI大鼠肺泡嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，提示Pdcd4可能通過這一途徑影響哮喘的發(fā)生和發(fā)展，但其進(jìn)一步可能產(chǎn)生的效應(yīng)及具體的機(jī)制需要后續(xù)進(jìn)行深入研究。