楊艷艷，程小莉，馬小琴，陳 釗，田李芳，高 潔，景蘭梅，姚 恬，李秋艷，盧家美，姚綱練，付榮國(guó)，王 莉

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，陜西西安 710004)

我國(guó)成年人群中慢性腎臟病的患病率高達(dá)10.8%，龐大的患者基數(shù)和終末期后的醫(yī)療資源消耗已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。多種原因可引起腎臟結(jié)構(gòu)改變與功能障礙，導(dǎo)致慢性腎臟病。雖然各種慢性腎臟病的臨床與病理表現(xiàn)存在差異，但是巨噬細(xì)胞(Mφ)浸潤(rùn)是各種慢性腎臟病的普遍特征[2-3]。Mφ與腎小管上皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，損傷內(nèi)皮/上皮屏障，同時(shí)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子以及活性氧等，促進(jìn)腎臟炎癥發(fā)生和腎間質(zhì)纖維化，參與慢性腎臟病的進(jìn)展[4-6]。Mφ在各類(lèi)慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后中均有一定作用[7]。然而，目前并不清楚不同病理類(lèi)型慢性腎臟病中的Mφ浸潤(rùn)程度和特點(diǎn)的差異。本研究對(duì)此進(jìn)行觀察與分析，探討Mφ在各種慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源2013年9月-2016年3月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科住院并行腎活檢的腎臟病患者110例，其中男性61例，女性49例，年齡為12～69歲。另選11例外傷后腎切除患者(排除腎臟原發(fā)疾病)腎標(biāo)本為正常對(duì)照。按照世界衛(wèi)生組織1982年診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)腎臟病理檢查明確患者的慢性腎臟病診斷。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)染色小鼠抗人CD68一抗，酶標(biāo)二步法檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司。

腎臟患者活檢標(biāo)本和正常對(duì)照腎臟標(biāo)本行常規(guī)石蠟包埋、切片，隨后脫蠟至水，抗原熱修復(fù)處理，30 mL/L H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，100 mL/L羊血清封閉，加入抗CD68一抗(mouse anti-human CD68, 1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，PBS清洗后加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h，PBS清洗后，加入DAB顯色液顯色。隨后脫水透明，封片后照相觀察。

用Image-J圖像分析軟件測(cè)定Mφ浸潤(rùn)面積，計(jì)算其與腎組織總面積的百分比，以反映Mφ浸潤(rùn)程度。陰性對(duì)照組切片不用CD68抗體孵育，其余步驟同上，用以確定染色的特異性。

1.3 腎組織Masson 染色石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)蘇木素作用10 min，流水沖洗數(shù)分鐘，再經(jīng)麗春紅酸性品紅染色8 min，用蒸餾水稍洗，經(jīng)磷鉬酸溶液處理5 min，此時(shí)勿洗，直接用苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，再經(jīng)10 mL/L冰醋酸處理2 min，然后經(jīng)950 mL/L乙醇、無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，用中性樹(shù)膠封片，于光鏡下觀察。用Image-J圖像分析軟件測(cè)定腎纖維化面積。

1.4 臨床指標(biāo)檢測(cè)及其與腎Mφ浸潤(rùn)的相關(guān)分析患者尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)采用顯微鏡40倍物鏡視野下尿沉渣鏡檢。血白蛋白采用溴甲酚綠法測(cè)定。血肌酐和尿素氮分別采用肌氨酸氧化酶法和脲酶紫外速率法測(cè)定。24 h尿蛋白定量采用焦酚紅法。胱抑素C用免疫比濁法測(cè)定。采用Pearson相關(guān)分析方法測(cè)定患者臨床指標(biāo)與腎Mφ浸潤(rùn)程度的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析或者Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，并應(yīng)用Pearson方法對(duì)Mφ浸潤(rùn)程度與腎纖維化進(jìn)行相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同類(lèi)型慢性腎臟病患者腎Mφ的浸潤(rùn)情況腎組織CD68免疫染色在每個(gè)樣本均可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞，陰性對(duì)照切片未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明染色特異性強(qiáng)。各類(lèi)腎臟病中Mφ主要浸潤(rùn)于腎小管間質(zhì)區(qū)域，偶見(jiàn)分布于腎小球毛細(xì)血管叢和腎小管管腔，其分布形式與病變部位相關(guān)(圖1)。

Mφ在腎臟不同病理類(lèi)型中浸潤(rùn)程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其浸潤(rùn)程度自高向低依次為狼瘡性腎炎(0.370±0.109)%、系膜增生性腎炎伴慢性間質(zhì)或血管病變(0.275±0.132)%、IgA腎病(0.270±0.154)%、糖尿病腎病(0.167±0.072)%、紫癜性腎炎(0.165±0.078)%、膜性腎病(0.148±0.071)%、系膜增生性腎炎(0.124±0.061)%，而正常腎組織為(0.059±0.038)%，陰性對(duì)照為(0.023±0.006)%；除系膜增生性腎炎外，其余各種慢性腎臟病中的腎Mφ浸潤(rùn)比例均高于對(duì)照組(P<0.01)。各組間比較的結(jié)果顯示，狼瘡性腎炎較其他各種慢性腎臟病Mφ浸潤(rùn)明顯增多(P<0.05)，IgA腎病和系膜增生伴慢性間質(zhì)或血管病變的組間Mφ浸潤(rùn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩類(lèi)疾病較膜性腎病、糖尿病腎病、紫癜性腎炎、系膜增生性腎炎的腎Mφ浸潤(rùn)明顯增多(P<0.05，圖2)。

圖1 不同類(lèi)型腎疾病患者腎臟CD68的染色情況Fig.1 CD68 staining in the kidneys of patients with different renal diseasesA:正常腎組織;B:系膜增生性腎炎;C:系膜增生性腎炎伴慢性腎間質(zhì)病變;D:膜性腎病;E:IgA腎病;F:糖尿病腎病;G:紫癜性腎炎;H:狼瘡性腎炎:I:陰性對(duì)照。標(biāo)尺為50μm。

圖2 不同類(lèi)型腎疾病的腎組織Mφ浸潤(rùn)程度的比較

Fig.2 The degree of macrophage infiltration in the kidneys of patients with different renal diseases

與正常對(duì)照相比，**P<0.01；與系膜增生性腎炎、膜性腎病、糖尿病腎病、紫癜性腎炎等組相比，#P<0.05；與其他腎臟病組相比，△P<0.05。

2.2 不同類(lèi)型慢性腎臟病患者臨床指標(biāo)與腎Mφ浸潤(rùn)的關(guān)系110例不同慢性腎臟病患者的性別分布和尿素氮水平無(wú)明顯差異，而年齡、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24 h尿蛋白定量、血漿白蛋白水平、血肌酐、胱抑素C和腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同慢性腎臟病患者的血肌酐、尿素氮、胱抑素C和eGFR與腎臟Mφ浸潤(rùn)程度存在相關(guān)性，隨著Mφ浸潤(rùn)程度的增加，血肌酐、尿素氮、胱抑素C水平逐漸增高，eGFR逐漸下降(表1)。

2.3 不同類(lèi)型慢性腎臟病患者腎纖維化程度及與腎Mφ浸潤(rùn)的關(guān)系Masson染色將腎臟纖維化區(qū)域染成綠色，統(tǒng)計(jì)綠色區(qū)域面積可反映纖維化程度。不同病理類(lèi)型的慢性腎臟病患者的腎臟纖維化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組間分析結(jié)果顯示，狼瘡性腎炎較其他各種慢性腎臟病纖維化程度加重(P<0.05)，IgA腎病、糖尿病腎病和系膜增生伴慢性間質(zhì)或血管病變?nèi)M間纖維化程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但纖維化程度重于膜性腎病、紫癜性腎炎、系膜增生性腎炎(P<0.05)，系膜增生性腎炎與正常腎組織間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、圖4)。慢性腎臟病纖維化程度和Mφ浸潤(rùn)程度的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二者呈線性正相關(guān)關(guān)系(r=0.822，P<0.01，圖5)。

3 討 論

腎Mφ浸潤(rùn)是多種慢性腎臟疾病的重要病理特征。本研究進(jìn)一步證實(shí)，在多種腎臟疾病，包括狼瘡性腎炎、糖尿病腎病、紫癜性腎炎、IgA腎病、膜性腎病、系膜增生性腎炎，患者的腎組織均有明顯的Mφ浸潤(rùn)。雖然多種腎臟疾病存在腎Mφ浸潤(rùn)，但是腎Mφ浸潤(rùn)程度與腎臟疾病類(lèi)型有著一定的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡性腎炎患者的腎Mφ浸潤(rùn)程度明顯高于其他類(lèi)型腎臟疾病，說(shuō)明狼瘡性腎炎更容易引起Mφ浸潤(rùn)。系膜增生性腎炎雖然有明顯的腎臟損害表現(xiàn)，但是其腎Mφ浸潤(rùn)程度較小，與正常腎組織差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示系膜增生性腎炎的病理改變對(duì)Mφ趨化作用較弱。當(dāng)系膜增生性腎炎伴發(fā)慢性間質(zhì)或者血管病變時(shí)，間質(zhì)和血管病變引發(fā)炎癥反應(yīng)，腎Mφ浸潤(rùn)明顯增加。腎Mφ浸潤(rùn)程度取決于腎臟炎癥程度和炎癥類(lèi)型，而不同腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制不同，腎Mφ浸潤(rùn)程度也有所不同。

表1 不同類(lèi)型慢性腎臟病患者的臨床指標(biāo)及各指標(biāo)與Mφ浸潤(rùn)程度的相關(guān)性

Tab.1 The clinical parameters and their relationship with macrophage infiltration in patients with different renal diseases

腎病類(lèi)型例數(shù)年齡(歲)性別(男∶女)尿紅細(xì)胞/HP尿蛋白(mg/24h)白蛋白(g/L)肌酐(mmol/L)尿素氮(mmol/L)胱抑素C(mg/L)eGFR[(mL/(min·1.73m2)]系膜增生性腎炎941.33±16.646:3144.38±206.024373.80±3173.4631.23±11.0874.71±11.044.75±1.981.01±0.2694.45±29.74系膜增生伴慢性 間質(zhì)或血管病變1548.47±15.756:9129.65±212.683644.46±2493.7434.13±10.23187.28±216.9612.73±12.051.85±1.5365.75±41.97膜性腎病1746.06±13.7010∶759.82±39.666005.50±3649.5831.20±5.8071.62±21.215.03±1.741.04±0.3197.85±27.68IgA腎病4038.00±18.6419∶21401.04±594.432797.09±2544.5739.67±6.82130.51±101.007.12±3.971.69±1.1874.35±38.24糖尿病腎病652.17±8.804∶249.00±77.735551.37±4649.7933.62±10.2086.86±22.606.77±2.121.43±0.5176.06±24.29紫癜性腎炎1138.82±20.827∶4347.67±496.602421.89±2084.2938.23±7.7666.41±20.165.49±2.061.02±0.15124.05±60.54狼瘡性腎炎1227.5±11.719∶391.65±155.693238.17±1981.8329.48±6.19113.60±83.879.44±6.892.16±1.7179.81±45.33組間比較P<0.01NSP<0.05P<0.01P<0.01P<0.05NSP<0.01P<0.01與M?浸潤(rùn)相關(guān)性NSNSNSNSNSr=0.459P<0.01r=0.328P<0.01r=0.489P<0.01r=-0.400P<0.01

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，NS為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 不同類(lèi)型腎疾病的腎組織Masson染色情況Fig.3 Masson staining of the kidneys of patients with different renal diseasesA:正常腎組織;B:系膜增生性腎炎;C:系膜增生性腎炎伴慢性腎間質(zhì)病變;D:膜性腎病;E:IgA腎病;F:糖尿病腎病;G:紫癜性腎炎;H:狼瘡性腎炎:I:陰性對(duì)照。標(biāo)尺為50μm。

本研究發(fā)現(xiàn)，腎Mφ浸潤(rùn)程度與患者的血肌酐、尿素氮、胱抑素C水平呈正相關(guān)，與腎小球?yàn)V過(guò)率呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明腎Mφ浸潤(rùn)程度總體上與腎臟疾病患者的腎功能損害程度相一致。有研究表明，在IgA腎病患者中，IgA腎病分級(jí)程度越高，腎損傷越嚴(yán)重，腎Mφ浸潤(rùn)程度也最嚴(yán)重，預(yù)后越差[8-9]。本研究對(duì)幾種不同類(lèi)型的腎臟疾病的研究進(jìn)一步證實(shí)，腎Mφ浸潤(rùn)程度與腎功能損傷嚴(yán)重程度相關(guān)。腎Mφ浸潤(rùn)與腎損傷之間是一個(gè)相互促進(jìn)的過(guò)程。腎損傷越嚴(yán)重，引發(fā)的炎癥反應(yīng)越劇烈，釋放細(xì)胞因子趨化單核細(xì)胞的作用越強(qiáng)，造成腎Mφ浸潤(rùn)程度越嚴(yán)重[10]。另一方面，Mφ通過(guò)釋放促炎癥和促損傷因子，進(jìn)一步造成組織細(xì)胞損傷[11]。本研究雖然證實(shí)腎Mφ浸潤(rùn)與腎功能損害在不同腎臟疾病存在相關(guān)性，但是腎Mφ在各種不同腎疾病發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待在模型動(dòng)物等研究中進(jìn)一步闡明。

圖4 不同類(lèi)型腎臟疾病的腎組織Masson染色結(jié)果的比較

Fig.4 Analysis of renal Masson staining of patients with different renal diseases

與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與系膜增生性腎炎、膜性腎病、紫癜性腎炎等組相比，#P<0.05；與其他腎臟病組相比，△P<0.05。

圖5 腎Mφ浸潤(rùn)面積和腎纖維化程度的相關(guān)性

Fig.5 Correlation between the area of renal macrophage infiltration and renal fibrosis

本研究表明，腎Mφ浸潤(rùn)程度與腎纖維化程度呈正相關(guān)。腎Mφ在腎纖維化中起著兩方面的作用：一方面腎Mφ可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、金屬蛋白酶(MMPs)、白細(xì)胞介素等因子加重腎纖維化[12-14]；另一方面，腎Mφ可吞噬死亡的組織細(xì)胞，分泌生長(zhǎng)因子，促進(jìn)組織的修復(fù)，減輕纖維化，這在疾病后期轉(zhuǎn)歸中十分重要[15]。目前認(rèn)為，不同表型Mφ分別參與促進(jìn)和抑制纖維化的過(guò)程[16]。腎Mφ浸潤(rùn)程度與腎纖維化程度呈正相關(guān)，這提示腎Mφ在本研究的各種腎疾病患者腎臟中主要參與了纖維化過(guò)程，與患者疾病處于發(fā)病活躍期而非轉(zhuǎn)歸期有關(guān)。當(dāng)腎纖維化發(fā)生后，腎功能難以逆轉(zhuǎn)，因此，減輕腎纖維化對(duì)疾病預(yù)后十分關(guān)鍵。在疾病發(fā)生發(fā)展的早期，減少M(fèi)φ浸潤(rùn)有望減輕腎纖維化，改善疾病預(yù)后。已有研究證實(shí)，去除Mφ可減輕腎纖維化[17]；誘導(dǎo)Mφ表型變化，促進(jìn)其組織修復(fù)能力，也可有效減輕腎纖維化[18]。本研究中，多種腎臟疾病腎Mφ浸潤(rùn)與腎纖維化程度呈正相關(guān)，這提示減少腎Mφ浸潤(rùn)對(duì)多種腎臟疾病的預(yù)后均有益處。

總之，本研究在多種腎臟疾病中，明確了腎Mφ浸潤(rùn)的情況和其與腎功能損傷、腎纖維化的相關(guān)關(guān)系，指出腎Mφ浸潤(rùn)程度在不同腎臟疾病存在一定的差異，這種差異原因仍有待今后明確。本研究結(jié)果表明，腎Mφ浸潤(rùn)程度與腎纖維化的正相關(guān)關(guān)系，為抑制腎Mφ浸潤(rùn)以改善疾病預(yù)后提供了依據(jù)。但本研究的主要不足是未能明確腎Mφ的具體表型，這需要在今后繼續(xù)研究，從而加深認(rèn)識(shí)Mφ參與腎功能損害的機(jī)制。