崔慧霞，李 妍，孟 迪，史緒生，張 佩，姜又紅，張文陸

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，遼寧錦州 121001；2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所生物治療室，遼寧沈陽(yáng) 110001；3. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，遼寧錦州 121001)

手術(shù)、放療和化療是腫瘤患者的3大治療方式。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，生物治療逐漸成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，成為了繼3大治療后的第四大治療方式[1]。其中，免疫細(xì)胞治療是腫瘤生物治療的最核心部分，抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)，尤其是CD8+CTL與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer, CIK)是免疫細(xì)胞治療中最主要的腫瘤殺傷細(xì)胞，被廣泛研究和應(yīng)用[2]。而鮮有研究其對(duì)相同的靶細(xì)胞殺瘤效果的觀察。乳腺珠蛋白A(mammaglobin-A, MGBA)是乳腺癌專一性過(guò)表達(dá)的一種蛋白[3]，本研究用MGBA腺病毒轉(zhuǎn)染人樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)，再用DC細(xì)胞制備MGBA抗原特異性CD8+CTL與CIK細(xì)胞，比較對(duì)乳腺癌的殺瘤效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑新鮮外周血來(lái)源于健康志愿者；乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-415和MDA-MB-231購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司；腺病毒Ad-null和Ad-MGBA為本室構(gòu)建；細(xì)胞因子GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、CD3單抗等均購(gòu)自廈門特寶公司；藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人CD80、別藻青蛋白(APC)標(biāo)記的鼠抗人CD83、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD86、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD8及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司；人CD8+T細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒購(gòu)自DYNAL公司；PE/7AAD凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 DC細(xì)胞的體外培養(yǎng)和表型檢測(cè)用密度梯度離心法提取健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37 ℃、50 mL/L CO2條件下靜置培養(yǎng)2 h，移除非貼壁細(xì)胞(用于后續(xù)CIK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的制備)，貼壁細(xì)胞用含1 000 IU/mL GM-CSF和500 IU/mL IL-4的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子。第5天，按MOI 200加入表達(dá)人MGBA的重組腺病毒Ad-MGBA，第6天加入TNF-α 1 000 IU/mL，第7天收獲成熟DC細(xì)胞，用于后續(xù)研究。于培養(yǎng)的第1、5、7天用倒置相差顯微鏡觀察DC細(xì)胞的形態(tài)變化，并分別加入CD80、CD83、CD86熒光抗體及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型分析。

1.3 CIK細(xì)胞的制備制作DC細(xì)胞時(shí)的未貼壁細(xì)胞，部分用于CIK細(xì)胞制備，部分用于CTL細(xì)胞制備。制作CIK時(shí)，用含有終濃度為100 IU/mL IL-1、500 IU/mL IL-2、50 ng/mL CD3單克隆抗體培養(yǎng)，每3 d補(bǔ)充細(xì)胞因子。第7天收集轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞，以DC∶CIK=1∶10的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，至第14天收獲。在CIK培養(yǎng)的第1、7、14天用CD56抗體、CD3抗體檢測(cè)CIK的CD3+CD56+陽(yáng)性的細(xì)胞比例。

1.4 CTL細(xì)胞的制備制作DC細(xì)胞時(shí)的部分未貼壁細(xì)胞，用含1 000 IU/mL IL-2的培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d補(bǔ)充細(xì)胞因子，用于CTL細(xì)胞的培養(yǎng)。收集第7天成熟的DC細(xì)胞，添加終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的絲裂霉素于37 ℃ 30 min，再用RPMI 1640不全培養(yǎng)液洗3遍，制成刺激細(xì)胞。以DC∶CTL=1∶10的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)液為CTL液，至第14天收獲。

1.5 MGBA抗原特異性CD8+CTL細(xì)胞的分選按磁珠分選試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行分選。收集成熟的CTL細(xì)胞，加入抗人CD8抗體，孵育、洗滌、離心、重懸，再加磁珠，繼續(xù)孵育，置磁力架提純、洗脫、重選等程序后獲得高純度的CD8+CTL細(xì)胞。用CD8抗體檢測(cè)分選前后CD8+CTL細(xì)胞的比例。

1.6 用流式細(xì)胞術(shù)分析CD8+CTL和CIK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性將上述制備的CD8+CTL細(xì)胞和CIK細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞系即MDA-MB-415細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞按效靶比為20∶1的比例進(jìn)行共培養(yǎng)12 h，然后用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行免疫染色，對(duì)乳腺癌細(xì)胞畫門后流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 DC細(xì)胞的形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)的DC細(xì)胞：第1天，DC細(xì)胞體積較小，比較松散；第5天細(xì)胞呈現(xiàn)小集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞周圍開始出現(xiàn)毛刺；加入腺病毒轉(zhuǎn)染繼續(xù)刺激DC細(xì)胞的進(jìn)一步成熟，培養(yǎng)至第7天時(shí)，發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞呈現(xiàn)典型的毛刺樣外觀，大部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大(圖1)。

2.2 DC細(xì)胞的表型檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)的DC細(xì)胞表面共刺激分子CD80、DC83、CD86的表達(dá)變化，可見隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)均得到提高，第2、5、7天的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2、表1)，提示DC細(xì)胞的成熟。

2.3 激活的CIK細(xì)胞表型檢測(cè)CIK是一群異質(zhì)細(xì)胞，其中CD3+CD56+陽(yáng)性的細(xì)胞是其典型的殺傷細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，CD3+CD56+陽(yáng)性細(xì)胞比例隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高(分別為3.47±1.38、20.19±4.45、40.74±10.63)，且在第1、7、14天的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.554，P=0.014，圖3)，顯示CIK的殺傷活性逐漸增強(qiáng)。

圖1 相差顯微鏡觀察不同培養(yǎng)階段的DC細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)

Fig.1 Morphological characteristics of DCs on different days under the phase-contrast microscope (×400)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)DC細(xì)胞的表型變化

Fig.2 Surface protein expression of DCs on different days

表1 各時(shí)間點(diǎn)DC細(xì)胞表型變化的比較

Tab.1 Comparison of surface protein expression of DCs on different days

(n=8)

2.4 分選前后CD8+CTL細(xì)胞的檢測(cè)CTL為抗原特異性細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞，其中CD8+CTL是主要的殺傷細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選前后CD8+CTL的比例，分選前CD8+CTL細(xì)胞比例僅占17.51%，而用免疫磁珠分選后則高達(dá)99.73%(圖4)，提示分選后的純度很高，分選成功。

2.5 抗原特異性CD8+CTL和CIK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性凋亡流式試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，CD8+CTL和CIK對(duì)表達(dá) MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-415細(xì)胞殺傷率分別是63.07%和48.35%；對(duì)不表達(dá)MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷率是14.62%和29.29%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2、圖5)。

圖3 不同時(shí)間CD3+CD56+CIK細(xì)胞比例的檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 The percentage of CD3+CD56+CIKs on different days

圖4 分選前后CD8+CTLs細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 Percentage of CD8+CTLs before and after purification

表2 MGBA抗原特異性CD8+CTL和CIK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的比較

Tab.2 Comparison of the cytotoxic effect of CD8+CTLs and CIKs on breast cancer cells (n=6, %)

乳腺癌細(xì)胞CIK平均殺傷率CD8+CTLs平均殺傷率tPMDA-MB-41548.35±5.5863.07±8.663.1000.027MDA-MB-23129.29±3.1914.62±1.604.8910.005 t11.90414.602 P<0.001<0.001

圖5 MGBA抗原特異性CD8+CTL和CIK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性分析

Fig.5 The cytotoxic effects of MGBA specifically stimulated CD8+CTLs and CIKs on breast cancer cells

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；B：對(duì)乳腺癌細(xì)胞畫門方式；C：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；**P<0.01。

3 討 論

由于各種因素導(dǎo)致腫瘤的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高，而治愈率低。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療是治療腫瘤的3大治療手段，但仍然不能很好控制腫瘤，急需找到一種更好的治療方式，而腫瘤細(xì)胞免疫治療因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而成為研究熱點(diǎn)，如抗原遞呈細(xì)胞DC細(xì)胞，以及腫瘤殺傷細(xì)胞如CTL、CIK、自然殺傷細(xì)胞(nature killer, NK)等[1]。

DC細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，隨著DC的成熟，其表面共刺激分子的表達(dá)也在提高[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn)，在DC細(xì)胞培養(yǎng)的初期，細(xì)胞體積較小，表達(dá)共刺激分子CD80、CD83、CD86的量較少，培養(yǎng)第5天出現(xiàn)明顯升高，而轉(zhuǎn)染后24 h，培養(yǎng)的第7天表達(dá)量分別達(dá)到87.23%、31.07%和79.68%，說(shuō)明絕大多數(shù)DC細(xì)胞都達(dá)到了成熟，從而利于抗原的遞呈和對(duì)其他免疫殺傷細(xì)胞的免疫激活。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，DC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后無(wú)論從毛刺樣外觀還是共刺激分子的表達(dá)都明顯提高，提示腺病毒轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，這在本研究團(tuán)隊(duì)的其他研究中已有報(bào)道[4]。

CIK細(xì)胞是一群異質(zhì)細(xì)胞。其中表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白的細(xì)胞(CD3+CD56+CIK)是CIK中主要的效應(yīng)細(xì)胞，也稱為自然殺傷細(xì)胞型淋巴細(xì)胞，既具有T淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點(diǎn)[5-6]。因此，很多研究中常檢測(cè)CD3+CD56+CIK以檢驗(yàn)體外培養(yǎng)是否成功。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著CIK培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CD3+CD56+CIK細(xì)胞的比例逐漸提高，在第1天時(shí)平均僅占3.47%，而在第7天與DC細(xì)胞共培養(yǎng)前為20.19%，而共培養(yǎng)7 d則平均高達(dá)40.74%，顯示培養(yǎng)成功，也提示與DC細(xì)胞共培養(yǎng)能夠刺激CIK中有效殺傷細(xì)胞的比例。這與其他研究的結(jié)果是一致的[6-7]。

CTL為抗原特異性細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞，其中CD8+CTL是主要的殺傷細(xì)胞[8]。DC細(xì)胞通過(guò)MHC-抗原肽復(fù)合體與T細(xì)胞受體識(shí)別，并通過(guò)DC細(xì)胞表面的共刺激分子如CD80、CD83、CD86等與T細(xì)胞表面的配體結(jié)合，從而激活T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂锌乖禺愋缘募?xì)胞毒性殺傷細(xì)胞，對(duì)于表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞起到有效的殺傷作用。本研究體外擴(kuò)增T細(xì)胞并與轉(zhuǎn)染后表達(dá)MGBA的DC細(xì)胞共培養(yǎng)，刺激制備MGBA抗原特異性CD8+CTL，用磁珠分選法提高純度。

那么抗原特異性CD8+CTL和同樣與DC細(xì)胞共培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，哪一種殺瘤更強(qiáng)呢？本研究中乳腺癌MDA-MB-415細(xì)胞表達(dá)該蛋白，而MDA-MB-231細(xì)胞不表達(dá)該蛋白[8]。CIK和CD8+CTL對(duì)MDA-MB-415細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)顯示，CD8+CTL的殺傷率達(dá)到63.07%，遠(yuǎn)高于CIK細(xì)胞的48.35%，說(shuō)明CD8+CTL細(xì)胞的針對(duì)性和特異性更強(qiáng)。而對(duì)不表達(dá)MGBA的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，CIK細(xì)胞的殺傷率達(dá)到29.29%，遠(yuǎn)高于CD8+CTL的14.62%，說(shuō)明CIK細(xì)胞的殺瘤譜廣，對(duì)于抗原不明確的腫瘤，CIK的殺傷效果要高于CD8+CTL。CIK對(duì)MDA-MB-415細(xì)胞的殺傷力高于MDA-MB-231細(xì)胞，說(shuō)明DC細(xì)胞對(duì)CIK細(xì)胞同樣的重要性，在培養(yǎng)過(guò)程中也產(chǎn)生了抗原特異性殺傷細(xì)胞，其中就包括CD8+T細(xì)胞。MGBA抗原特異性CD8+CTL對(duì)不表達(dá)MGBA的MDA-MB-231細(xì)胞殺傷活性很低，進(jìn)一步說(shuō)明其針對(duì)性和特異性更強(qiáng)。

綜上，DC細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)成熟，腺病毒轉(zhuǎn)染可促進(jìn)其進(jìn)一步成熟；CIK細(xì)胞也能在體外誘導(dǎo)激活，與DC細(xì)胞共培養(yǎng)能夠促進(jìn)CIK活化；表達(dá)特異抗原的DC細(xì)胞誘導(dǎo)CD8+CTL細(xì)胞的抗原特異性殺傷活性；抗原特異性CD8+CTL對(duì)于表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞的殺傷活性要高于CIK細(xì)胞；而CIK細(xì)胞的殺瘤譜廣，尤其對(duì)于不表達(dá)特異抗原的靶細(xì)胞，CIK的殺傷活性要高于CD8+CTL。這為對(duì)于有無(wú)表達(dá)特異抗原的腫瘤臨床治療提供了新思路。