張 雷，王宇鋒，王 亮，殷國志，韓少山，李瑞祥，鮮 瑤，姚德茂

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年外科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，陜西西安 710061)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。目前治療HCC首選的措施仍然是手術(shù)切除，盡管HCC的診治水平已經(jīng)有了明顯改善，但患者的總體預(yù)后仍然不容樂觀[1-2]。因此，尋找新的有效的HCC臨床診治措施是目前最為迫切的任務(wù)之一。作為靶向治療熱點(diǎn)領(lǐng)域之一的微小RNA(microRNA, miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為18～25個(gè)核苷酸序列的小分子RNA，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[3-5]。miRNA主要通過參與基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-450b-5p與橫紋肌肉瘤[7]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]、肺腺癌[9]、前列腺癌[10]以及結(jié)直腸癌[11]等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ZHANG等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-450b-5p可以作為LINC00319/miR-450b-5p/Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2(zeste gene enhancer of human homolog 2, EZH2)通路的一員參與肺腺癌惡性進(jìn)展；SUN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在橫紋肌肉瘤中，TGF-β1可以通過負(fù)向調(diào)控miR-450b-5p的表達(dá)發(fā)揮其作用。而有關(guān)miR-450b-5p在HCC中的表達(dá)及作用目前罕有報(bào)道。因此，本研究觀察miR-450b-5p在HCC中的表達(dá)情況、臨床意義及其對(duì)HCC細(xì)胞侵襲、遷移、增殖的影響，并初步探究其可能的作用機(jī)制，為HCC的預(yù)防和診治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集并篩選73例HCC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均來自2008年1月1日至2011年12月31日在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理診斷確診的HCC患者，其中男性62例，女性11例，年齡27～76歲，中位年齡51歲。癌旁組織為距腫瘤邊緣大于2 cm的肝組織。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等其他輔助治療。所有獲得的新鮮組織取得后均盡快保存于液氮或者多聚甲醛(40 g/L)中。本研究獲得西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)并獲得患者知情同意。

1.2 主要試劑Trizol試劑和脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)均購自Invitrogen公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司；DMEM購自ThermoFisher Scientific公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)、miRNA qPCR試劑盒(All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)、miR-450b-5p特異性引物(貨號(hào)：HmiRQP0508)、miRNA內(nèi)參U6引物(貨號(hào)：HmiRQP9001)、miR-450b-5p過表達(dá)類似物(miR-450b-5p mimics)(貨號(hào)：HmiR0495-MR04)、miR-450b-5p抑制劑(miR-450b-5p inhibitors)(貨號(hào)：HmiR-AN0508-AM01)均購自Genecopoeia公司；Transwell小室購自Becton Dickinson Labware公司；Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司；MTT試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RIPA裂解液(強(qiáng))購自西安赫特生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人SOX2多克隆抗體購自Abcam公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL 發(fā)光劑購自Milipore 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人正常永生化肝細(xì)胞(LO2)與肝癌細(xì)胞系(Hep3B、MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、MHCC-97H)均購自中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞培養(yǎng)液為含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)箱的條件為50 mL/L CO2、37 ℃。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000試劑說明書步驟進(jìn)行。將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6孔板中并培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為50%～70%。轉(zhuǎn)染前24 h，將正常血清更換為含100 mL/L胎牛血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染時(shí)，將100 nmol miR-450b-5p mimics(miR-450b-5p)與100 nmol陰性對(duì)照(miR-control)轉(zhuǎn)染至MHCC-97H細(xì)胞；同時(shí)，將100 nmol miR-450b-5p inhibitors(anti-miR-450b-5p)與100 nmol陰性對(duì)照(anti-miR)轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為LipofectamineTM2000。用含100 mL/L胎牛血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8 h，換成正常培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)及相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)使用Trizol試劑，按照說明書上的步驟提取組織和細(xì)胞中的總RNA，并用超微量核酸定量光譜儀(Thermo Nanodrop 1000)測(cè)定RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄操作分別按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)說明書步驟進(jìn)行。miRNA Real-time PCR按照miRNA qPCR( All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)試劑盒說明書步驟進(jìn)行，以U6為內(nèi)參。結(jié)果均應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)不鋪膠；侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將50 mg/L的Matrigel膠1∶6稀釋后均勻鋪于上層小室底部。將待測(cè)細(xì)胞消化、離心、重懸，使細(xì)胞密度為1×106/mL。在Transwell下層小室中加入700 μL含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基，取各組細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室。每組重復(fù)3次。48 h后取出小室，首先用PBS溶液將小室清洗3次，然后用棉簽將小室的微孔膜上層的Matrigel膠及細(xì)胞輕輕拭凈，接著用40 g/L多聚甲醛固定15 min，用1 g/L的結(jié)晶紫染色5 min，用PBS溶液洗凈后將小室置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并求其平均數(shù)，以此評(píng)估細(xì)胞的侵襲遷移能力。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)收集轉(zhuǎn)染24 h的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液接種至96孔板(每孔3×103個(gè)細(xì)胞)。各組細(xì)胞分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于接種24、48、72 h棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 g/L的二苯基溴化四氮唑藍(lán)(MTT)50 μL繼續(xù)孵育4 h，加入200 μL二甲基亞楓(DMSO)進(jìn)行終止。然后應(yīng)用光吸收酶標(biāo)儀(SpectraMax 190，美谷分子儀器公司)測(cè)定490 nm處的吸光度并進(jìn)行分析。

1.7 細(xì)胞蛋白抽提及Western blot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，用RIPA裂解液抽提各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將待檢測(cè)蛋白樣品按每孔30 μg上樣后行SDS-PAGE電泳，然后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L脫牛奶粉液封閉2 h，加入相應(yīng)的SOX2抗體(1∶1 000)或者β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，取膜室溫孵育30 min，用TBST溶液(TBS，1 mL/L Tween-20)洗膜，10 min×3次。分別加HRP標(biāo)記的抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。TBST(TBS，1 mL/L Tween-20)洗膜3次，10 min/次，暗室用ECL發(fā)光劑檢測(cè)。

1.8 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成SOX2-3′-UTR的野生序列和突變序列并進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的片段分別轉(zhuǎn)入pMIR-reporterTM的miRNA表達(dá)載體(Applied Biosystems)，構(gòu)建能夠表達(dá)熒光素酶的重組質(zhì)粒；構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別與miR-450b-5p mimic 或miR-450b-5p inhibitors 共同轉(zhuǎn)染MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞，72 h收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照Luciferase Reporter Gene Assay Kit 說明書操作實(shí)驗(yàn)。通過發(fā)光化學(xué)儀檢測(cè)螢火蟲和海腎熒光比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0等統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括單因素方差分析、t檢驗(yàn)、Pearsonχ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier法、Cox多因素回歸分析法、Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)等；用Graphpad prism 6及Adobe PhotoShop CS6等軟件進(jìn)行圖表繪制。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-450b-5p在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)Real-time PCR檢測(cè)73例HCC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中miR-450b-5p的表達(dá)結(jié)果顯示，miR-450b-5p在HCC組織中相對(duì)表達(dá)水平(0.346±0.014)明顯低于癌旁組織(0.913±0.024，P<0.05，圖1)。

圖1 Real-time PCR 檢測(cè)miR-450b-5p在HCC組織(HCC)和癌旁組織(NT)中的表達(dá)變化

Fig.1 Expressions of miR-450b-5p in HCC tissues and adjacent non-tumor tissues (NT) measured by Real-time PCR

與NT組比較，*P<0.05。

2.2 HCC中miR-450b-5p的臨床意義將73例HCC患者根據(jù)miR-450b-5p中位表達(dá)水平(0.340)分為miR-450b-5p高表達(dá)組(n=36)和miR-450b-5p低表達(dá)組(n=37)。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析miR-450b-5p的表達(dá)量與兩組患者臨床病理特征間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-450b-5p與腫瘤大小(P=0.026)、靜脈侵犯(P=0.013)及TNM分期(P=0.020)顯著相關(guān)，而與年齡、性別等特征無關(guān)(表1)。此外，應(yīng)用Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，miR-450b-5p高表達(dá)組的HCC患者的總體生存率明顯高于低表達(dá)組(圖2)。

表1 miR-450b-5p的表達(dá)水平與HCC臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 The correlation between miR-450b-5p expression and the clinicopathologic characteristics of HCC (n=73)

臨床病理特征例數(shù)miR-450b-5p的表達(dá)水平高(n=36)低(n=37)χ2P年齡(歲) <50231013 ≥50502624性別 男623131 女11560.0770.781AFP水平(ng/mL) <4001697 ≥4005727300.3940.530腫瘤大小(cm) <5332112 ≥54015254.9420.026腫瘤數(shù)(個(gè)) 1603228 ≥213492.1760.140靜脈侵犯 無513021 有226166.1210.013Edmondson病理分級(jí) Ⅰ+Ⅱ472720 Ⅲ+Ⅳ269173.4910.062TNM分期 Ⅰ+Ⅱ543123 Ⅲ+Ⅳ195145.4360.020

圖2 miR-450b-5p的表達(dá)水平與HCC患者預(yù)后的相關(guān)分析

Fig.2 The effect of miR-450b-5p expression on the prognosis of HCC patients

通過Cox多因素回歸分析法進(jìn)一步分析HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-450b-5p為HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素之一(表2)。

2.3 miR-450b-5p在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)情況Real-time PCR結(jié)果顯示，5種HCC細(xì)胞系(Hep3B、MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、MHCC-97H)中的miR-450b-5p的表達(dá)水平均低于正常肝細(xì)胞LO2(P均<0.05，圖3)。其中，MHCC-97H細(xì)胞表達(dá)最低，Hep3B的表達(dá)最高。因此，選擇MHCC-97H和Hep3B細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 miR-450b-5p抑制HCC細(xì)胞遷移和侵襲Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-450b-5p mimics能夠上調(diào)MHCC-97H細(xì)胞中miR-450b-5p的表達(dá)水平(P<0.05)，而miR-450b-5p inhibitors能夠下調(diào)Hep3B細(xì)胞中miR-450b-5p的表達(dá)水平(P<0.05，圖4)。

表2Cox多因素回歸分析法分析HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素

Tab.2Coxregression analysis of the independent prognostic factors for HCC patients

臨床因素單因素分析HR值P95% CI多因素分析HR值P95% CImiR-450b-5p的表達(dá)(高/低)2.8450.0251.367～4.4882.4230.0231.108～4.567年齡(歲)(<50/≥50)1.8840.6120.752～3.1680.8640.5120.522～1.54性別(男/女)2.3360.3661.378～5.6721.3620.4650.576～3.181AFP水平(ng/mL)(<400/≥400)3.9050.2410.429～6.6381.5650.1280.861～2.766腫瘤大小(cm)(<5/≥5)3.9780.0120.623～7.4651.4740.1420.893～2.430腫瘤數(shù)目(1/≥2)3.6710.0531.843～6.7541.1430.6280.679～1.889靜脈侵犯(無/有)3.2230.0361.689～10.0642.2190.0130.083～3.779Edmondson病理分級(jí)(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)1.3680.0470.358～4.5121.2520.4530.722～2.167TNM分期(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)2.1160.0210.539～5.8471.5070.0160.715～4.846

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，miR-450b-5p mimics能夠明顯抑制MHCC-97H細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)目[P<0.001，(55.330±1.453)vs.(19.330±1.202)]；而轉(zhuǎn)染miR-450b-5p inhibitors后的Hep3B細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)目明顯增多[P<0.001，(42.330±1.764)vs.(85.330±1.764)，圖5]。

圖3 Real-time PCR檢測(cè)HCC細(xì)胞系中的miR-450b-5p的表達(dá)情況

Fig.3 The expression of miR-450b-5p in HCC cell lines detected by Real-time PCR

與LO2比較，*P<0.05。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-450b-5p mimics能明顯抑制MHCC-97H細(xì)胞穿過小室膜[P<0.05，(35.000±1.155)vs.(11.670±1.764)]；而miR-450b-5p inhibitors能明顯促進(jìn)Hep3B細(xì)胞穿過小室膜[P<0.05，(24.330±1.202)vs.(52.670±1.453)，圖6]。

圖4 Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-450b-5p mimics或者inhibitors后HCC細(xì)胞中miR-450b-5p的表達(dá)變化

Fig.4 Real-time PCR was used to detect the expression of miR-450b-5p in HCC cells transfected with miR-450b-5p mimics or inhibitors

與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

圖5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-450b-5p表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞遷移能力的影響

Fig.5 Effect of miR-450b-5p on HCC cells migration examined by Transwell migration assay

A、B：鏡下觀察(×200)；C、D：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

2.5 miR-450b-5p抑制HCC細(xì)胞增殖MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，將miR-450b-5p mimics轉(zhuǎn)染至MHCC-97H細(xì)胞48、72 h，細(xì)胞增殖明顯抑制(P<0.05，圖7A)；而轉(zhuǎn)染miR-450b-5p inhibitors 48、72 h的Hep3B細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)(P<0.05，圖7B)。

2.6 性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y-box2, SOX-2)是miR-450b-5p的靶基因應(yīng)用生物信息學(xué)軟件(Targetscan, microRNA.org, miRBase)預(yù)測(cè)miR-450b-5p的靶基因。miR-450b-5p能夠與SOX2的3′非編碼區(qū)(untranslated region, 3′-UTR)結(jié)合(圖8A)，提示SOX2可能為miR-450b-5p的靶基因。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-450b-5p能負(fù)向調(diào)節(jié)野生型的SOX2-3′-UTR熒光素酶的活性，而對(duì)突變型的SOX2-3′-UTR的熒光素酶活性沒有影響(P均<0.05，圖8B)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，miR-450b-5p mimics明顯降低MHCC-97H細(xì)胞中SOX2的蛋白水平(P<0.05，圖8C)，而miR-450b-5p inhibitors明顯上調(diào)Hep3B細(xì)胞中SOX2的蛋白水平(P<0.05，圖8D)。

圖6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-450b-5p表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞侵襲能力的影響

Fig.6 The effect of miR-450b-5p on HCC cells invasion examined by Transwell invasion assay

A、B：鏡下觀察(×200)；C、D：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

圖7 MTT法檢測(cè)miR-450b-5p表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞增殖能力的影響

Fig.7 Effect of miR-450b-5p on HCC cells proliferation examined by MTT assay

與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

圖8 HCC細(xì)胞中miR-450b-5p能夠靶向作用于SOX2

Fig.8 SOX2 was the target of miR-450b-5p in HCC cells

A：生物信息學(xué)分析顯示，miR-450b-5p可與野生型的SOX2的3＇非編碼區(qū)結(jié)合(WT：野生型；MUT：突變型)；B：熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果；C、D：Western blot結(jié)果。與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

3 討 論

越來越多的研究表明，異常表達(dá)的miRNA與HCC細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-14]。ZHUANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HCC中高表達(dá)的miR-23b能夠通過靶向作用于腫瘤抑癌基因7L(suppression of tumorigenicity 7 like, ST7L)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移；ZHU等[16]研究表明，miR-10b在HCC中為高表達(dá)，能通過抑制CSMD1(CUB and Sushimultiple domains1)基因表達(dá)而發(fā)揮促HCC細(xì)胞侵襲遷移的作用；CAO等[17]研究表明，miR-101能夠抑制HCC細(xì)胞的侵襲遷移，Girdin基因?yàn)槠渥饔冒悬c(diǎn)。值得注意的是，近年來對(duì)食管癌、橫紋肌肉瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的研究均表明，miR-450b-5p可能與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、化療藥物敏感性及患者預(yù)后等密切相關(guān)[7-11,18]。這提示miR-450b-5p可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有一定的潛在臨床價(jià)值。但是，miR-450b-5p在HCC中研究目前尚罕有報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-450b-5p在HCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)均明顯降低。而且miR-450b-5p低表達(dá)與腫瘤大小、靜脈侵犯及TNM分期相關(guān)。此外，miR-450b-5p的表達(dá)水平與HCC患者的預(yù)后相關(guān)，miR-450b-5p高表達(dá)組的HCC患者預(yù)后較好，且miR-450b-5p表達(dá)水平為HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素之一。上述結(jié)果表明，miR-450b-5p可能為HCC的抑癌基因，并且可能將作為判斷HCC預(yù)后的臨床指標(biāo)。

為了探究miR-450b-5p對(duì)HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，本研究檢測(cè)了miR-450b-5p的表達(dá)改變對(duì)HCC細(xì)胞遷移、侵襲及增殖能力的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)HCC細(xì)胞中miR-450b-5p的表達(dá)水平改變之后，HCC細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖能力也隨之出現(xiàn)負(fù)向改變。上述結(jié)果表明，miR-450b-5p為HCC的抑癌基因，能夠抑制HCC細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖。

大量研究表明，miRNA能夠通過與下游靶基因的3′-UTR結(jié)合從而抑制靶基因的表達(dá)來發(fā)揮作用[9,15-16]。本研究采用的多種生物信息學(xué)工具(Targetscan, microRNA.org, miRBase)研究均顯示，miR-450b-5p能夠與SOX2 mRNA的3′-UTR結(jié)合，即SOX2為其潛在的靶基因。SOX2是SOX轉(zhuǎn)錄因子家族中一個(gè)主要成員，其對(duì)胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞等干細(xì)胞的再生能力以及多能性的維持具有重要作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，SOX2在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中作為原癌基因參與腫瘤的生物進(jìn)程中，其能夠通過作用于Slug、cyclin-E、p27等基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖能力[19-22]。因此，推測(cè)miR-450b-5p可能通過靶向作用于SOX2發(fā)揮其抗HCC的作用。為證實(shí)SOX2為miR-450b-5p的靶點(diǎn)，應(yīng)用熒光素酶報(bào)告和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-450b-5p能夠通過與SOX2的3′-UTR直接結(jié)合從而負(fù)向調(diào)控HCC細(xì)胞中SOX2的表達(dá)。上述結(jié)果表明，HCC細(xì)胞中，SOX2是miR-450b-5p的靶基因。結(jié)合既往研究，推測(cè)HCC細(xì)胞中miR-450b-5p通過靶向作用于SOX2，進(jìn)而影響SOX2對(duì)下游基因Slug、cyclin-E、p27等的調(diào)節(jié)，影響HCC細(xì)胞的遷移、侵襲以及增殖等。

綜上所述，本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的miR-450b-5p與HCC的腫瘤大小、靜脈侵犯、TNM分期及HCC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。此外，miR-450b-5p能夠通過靶向作用于SOX2抑制HCC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力。本研究將為HCC靶向治療的相關(guān)研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。