崔曉萍，陳建梅，葉建新，穆軍山，王魁花，林 航

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬教學(xué)醫(yī)院福州總醫(yī)院：1. 神經(jīng)內(nèi)科；2. 骨一科，福建福州 350001)

神經(jīng)干/祖細(xì)胞(neural stem/progenitor cells, NSPCs)具有自我更新和分化成多種神經(jīng)細(xì)胞的潛能，是研究神經(jīng)發(fā)育的理想模型；NSPCs作為潛在的修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的工具細(xì)胞，也具有很好的應(yīng)用前景。研究NSPCs自我更新的分子機(jī)制，明確調(diào)節(jié)NSPCs自我更新和神經(jīng)分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因?qū)τ陉U明神經(jīng)發(fā)育機(jī)制、了解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有重要意義，也是發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)以及實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)替代和功能重建等大規(guī)模臨床應(yīng)用的前提[1]。

參與NSPCs自我更新維持的一些基因如c-Myc、CIP2A等[2]，均是原癌基因，研究其在NSPCs中的功能，不僅有助于闡明神經(jīng)發(fā)育機(jī)制，對(duì)于NSPCs臨床應(yīng)用的安全性也至關(guān)重要。Nac-1(nucleus accumbens1)是POZ/BTB家族蛋白，因最先在大鼠腦伏核區(qū)發(fā)現(xiàn)得名，在腦組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，與可卡因成癮性有關(guān)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，Nac-1對(duì)多種腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)有促進(jìn)作用[3]，也是胚胎干細(xì)胞(ESCs)多能性維持的核心轉(zhuǎn)錄因子成員。而目前尚未見(jiàn)關(guān)于Nac-1在NSPCs的多能性維持中作用的報(bào)道。

NSPCs除了從胚胎和成體的腦組織中分離獲得，也可以通過(guò)誘導(dǎo)ESCs分化而產(chǎn)生。該細(xì)胞類(lèi)似胚胎皮質(zhì)心室區(qū)(VZ)的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，可以在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，在適當(dāng)條件下可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，還可充當(dāng)細(xì)胞支架支持祖細(xì)胞遷移。更重要的是，ESCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的NSPCs增殖速度快，并能夠在移植后修復(fù)腦損傷，有良好的臨床應(yīng)用前景[4]。本研究主要通過(guò)RNA干擾法敲低Nac-1的表達(dá)，研究Nac-1在ESCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的NSPCs自我更新維持中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購(gòu)自Gibco公司，細(xì)胞因子EGF和FGF2購(gòu)自Peprotech公司。RNA干擾載體shRNA和對(duì)照質(zhì)粒shCtrls購(gòu)自Sigma。為排除RNA干擾方法有可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)，選取了作用位點(diǎn)不同的兩個(gè)干擾序列，靶向Nac-1的序列[5]shRNA1：GATGAGCAGTACCGTCAGATC；shRNA2：GGTTTCCAGTCTGGCAGAA，由華大基因公司合成。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司，熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。Nac-1抗體購(gòu)自Abcam公司，c-Myc抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)說(shuō)明書(shū)將RNA干擾靶向序列插入shRNA載體，建立Nac-1 RNA干擾質(zhì)粒，命名為Nac1-shRNA1和Nac1-shRNA2。通過(guò)PCR從小鼠基因組DNA中擴(kuò)增c-Myc啟動(dòng)子[5]，上游引物(-2 520)：ACTGTGTGAGTTTCAGGCTAGCA，下游引物(+525)：AGCCTTCAAACAGCTCGAGGAG，并插入到pGL3-Basic載體中，建立pGL3-Myc。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染源自ESCs R1(ATCC)的NSPCs為本室保存，從ESCs分化而來(lái)，可以長(zhǎng)期傳代[4,6]，在含有20 ng/mL EGF和10 ng/mL FGF2的N2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每2 d更換1次。用含有10 mL/L FBS的N2B27進(jìn)行分化。貼壁培養(yǎng)時(shí)，用多聚-L-鳥(niǎo)氨酸和纖維結(jié)合蛋白包被細(xì)胞板。同時(shí)，常規(guī)培養(yǎng)293FT細(xì)胞(Invitrogen)，用于RNA干擾病毒的包裝。

將質(zhì)粒shCtrls、Nac1-shRNA1和Nac1-shRNA2分別與包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2G共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)操作。出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí)(轉(zhuǎn)染72 h)取培養(yǎng)上清，6 000 r/min離心取上清，即為對(duì)照病毒shCtrls-V和干擾病毒Nac1-shRNA-V1、Nac1-shRNA-V2。

轉(zhuǎn)染與分組：消化NSPCs并計(jì)數(shù)，分別取1×106細(xì)胞，對(duì)照組加入對(duì)照病毒shCtrls-V，實(shí)驗(yàn)組分別加入干擾病毒Nac1-shRNA-V1、Nac1-shRNA-V2，各組均同時(shí)加入4 μg/mL聚凝胺(Sigma)，37 ℃振搖轉(zhuǎn)染2 h后鋪板，培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)用Trizol試劑盒分別提取分化前后以及轉(zhuǎn)染各組的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR-PCR試劑，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒(Roche)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)。各待檢基因引物序列參照文獻(xiàn)[2, 4-5]，由華大公司合成，Western blot方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.5 細(xì)胞增殖曲線將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液并以1×103/cm2鋪于明膠包被的培養(yǎng)皿，每組3皿，分別在接種后4、6、8 d計(jì)數(shù)。通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)(臺(tái)盼藍(lán))染色排除死細(xì)胞，并在光學(xué)顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器手動(dòng)計(jì)數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，用FITC-AnnexinV和碘化丙啶(PI)雙染法，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。

1.7 熒光素酶分析用0.5 μg pGL3-Myc和0.01 μg pRL-SV40(Promega)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，pGL3-Basic作為空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后48 h裂解細(xì)胞并使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega)測(cè)量螢光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 Nac-1在NSPCs中高表達(dá)并隨著NSPCs的分化而下降該細(xì)胞系貼壁生長(zhǎng)成雙極性，在含有10 mL/L FBS的N2B27中分化7 d的NSPCs呈現(xiàn)多種形態(tài)(圖1A)。

定量PCR檢測(cè)顯示：本室傳代培養(yǎng)的NSPCs中，自我更新標(biāo)記物Pax6、SOX2的mRNA高水平表達(dá)，分化培養(yǎng)7 d后顯著下降；說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系能夠在體外維持自我更新。而神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物(其中神經(jīng)元：MAP2；星形膠質(zhì)：GFAP；少突膠質(zhì)：OSP)在分化細(xì)胞中顯著升高(圖1B)，說(shuō)明該細(xì)胞系有向多個(gè)神經(jīng)譜系分化的潛能?？梢?jiàn)，本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞系具有神經(jīng)干細(xì)胞的特性。

同時(shí)，在NSPCs分化前后，Nac-1的mRNA表達(dá)有明顯差異，分化后下降了77%(圖1B)，提示Nac-1可能在NSPCs的自我更新維持過(guò)程中發(fā)揮功能。

圖1 ESCs來(lái)源的NSPCs的鑒定

Fig.1 The identification of NSPCs derived from ESCs

A：NSPCs分化前后的形態(tài)比較；B：定量RT-PCR方法檢測(cè)NSPCs分化前后各種標(biāo)記物(自我更新：SOX2、Pax6；神經(jīng)元：MAP2；星形膠質(zhì)：GFAP；少突膠質(zhì)：OSP)的表達(dá)水平。與分化前相比較，*P<0.05。

2.2 Nac-1的敲低效果觀察及其對(duì)NSPCs增殖的影響定量PCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組(對(duì)照病毒shCtrls-V感染NSPCs)相比，實(shí)驗(yàn)組(感染干擾病毒Nac1-shRNA-V1、Nac1-shRNA-V2的NSPCs)中Nac-1的mRNA水平均顯著下降，干擾效率分別是69%和66%；Nac-1的蛋白水平檢測(cè)也顯示RNA干擾取得了預(yù)期的效果(P<0.05，圖2)。

Nac-1敲低時(shí)(實(shí)驗(yàn)組)NSPCs死細(xì)胞明顯增多；增殖曲線顯示，細(xì)胞增殖效率明顯降低；Annexin-V染色的流式檢測(cè)結(jié)果顯示，Nac-1敲低時(shí)，細(xì)胞凋亡率比對(duì)照細(xì)胞顯著增高，特別是早期凋亡增高明顯，從4.13%增加到11.1%和9.62%(P<0.05，圖3)。Nac-1的表達(dá)水平與NSPCs的凋亡率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，提示Nac-1可能具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，這可能是Nac1影響NSPCs增殖的主要原因。

圖2 Nac-1敲低的NSPCs中Nac-1的mRNA和蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 The mRNA and protein expression of Nac-1 in NSPCs with Nac-1 knockdown

A：定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果。shCtrls：對(duì)照病毒感染組(對(duì)照組)；shRNA1、shRNA2：干擾病毒感染組(實(shí)驗(yàn)組)。與對(duì)照組(shCtrls)比較，*P<0.05。

2.3 Nac-1敲低對(duì)NSPCs分化潛能的影響定量PCR檢測(cè)NSPCs的自我更新和分化標(biāo)志物的mRNA水平，結(jié)果顯示，Nac-1敲低時(shí)細(xì)胞中SOX2和Pax6表達(dá)降低，而神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物MAP2、GFAP和OSP均有升高(圖4)。說(shuō)明Nac-1對(duì)NSPCs的干性維持有重要作用。

2.4 Nac-1對(duì)c-Myc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用對(duì)凋亡途徑P53通路的活化情況和c-Myc的mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，p53和p21(p53的靶基因，其表達(dá)水平可反映p53通路的活化)的mRNA表達(dá)在Nac-1敲低的NSPCs中變化不明顯，而c-Myc的mRNA表達(dá)在Nac-1敲低時(shí)分別降低了46%和57%(圖4)。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示c-Myc的蛋白表達(dá)變化(圖5A)與mRNA變化一致，說(shuō)明c-Myc的表達(dá)可能受到Nac-1的調(diào)控。

熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Nac-1敲低組細(xì)胞中，熒光素酶的活性下降了24%和36%；Nac-1敲低時(shí)NSPCs中c-Myc表達(dá)降低(圖5B)，說(shuō)明Nac-1可調(diào)控NSPCs中c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性。

Nac-1缺失引起的增殖緩慢、凋亡增加以及趨于分化等表型變化，可能均與c-Myc水平降低有關(guān)。另外，c-Myc還有促進(jìn)NSPCs自我更新的作用[2]，故Nac-1對(duì)NSPCs自我更新的影響可能也由c-Myc介導(dǎo)。

圖3 RNA干擾敲低Nac-1時(shí)NSPCs的增殖和凋亡情況Fig.3 Detection of proliferation and apoptosis of NSPCs with Nac-1 knockdownshCtrls:對(duì)照病毒感染組(對(duì)照組);shRNA1、shRNA2:干擾病毒感染組(實(shí)驗(yàn)組)。A:細(xì)胞形態(tài)觀察;B:增殖曲線;C:細(xì)胞凋亡。

圖4 Nac-1敲低時(shí)NSPCs中自我更新、分化及凋亡標(biāo)志物的mRNA表達(dá)變化

Fig.4 mRNA expression of self-renewal, differentiation and apoptosis markers in NSPCs with Nac-1 knockdown

shCtrls：對(duì)照病毒感染組(對(duì)照組)；shRNA1、shRNA2：干擾病毒感染組(實(shí)驗(yàn)組)。與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討 論

Nac-1在腦組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，既往的研究主要集中在其與可卡因成癮性的關(guān)系。本研究主要關(guān)注Nac-1在NSPCs自我更新維持中的作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低Nac-1表達(dá)，不僅不利于NSPCs增殖，也不利于其干性維持，因此，Nac-1是NSPCs自我更新所必需。

Nac-1所屬的POZ/BTB蛋白家族，包括涉及正常細(xì)胞周期調(diào)控和特定惡性腫瘤發(fā)展的幾種轉(zhuǎn)錄因子(BCL6和PLZF等)，可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄作用調(diào)控果蠅和哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[8]。Nac-1與其他的POZ/BTB蛋白家族成員不同之處是其沒(méi)有典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其C末端的BEN基序可能介導(dǎo)Nac-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，但其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用尚不明確。本研究顯示，Nac-1可以調(diào)控NSPCs中c-Myc的轉(zhuǎn)錄，并在NSPCs自我更新維持中必不可少。有研究報(bào)道，ESCs中Nac-1的功能發(fā)揮也與c-Myc有關(guān)[5]，提示Nac-1/c-Myc可能是ESCs和NSPCs干性維持共有的調(diào)節(jié)途徑。

圖5 Nac-1敲低影響c-Myc的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平

Fig.5 Nac-1 knockdown reduced the transcription and expression levels of c-Myc

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nac-1敲低對(duì)c-Myc啟動(dòng)子活性的影響。shCtrls：對(duì)照病毒感染組(對(duì)照組)；shRNA1、shRNA2：干擾病毒感染組(實(shí)驗(yàn)組)。與對(duì)照組(shCtrls)比較，*P<0.05。

另一方面，Nac-1含有介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用的保守結(jié)構(gòu)域，在ESCs中可以和Oct4、Nanog等核心轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，共同發(fā)揮作用；在腫瘤相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，Nac-1能與組蛋白乙?；窰DAC3、HDAC4結(jié)合，影響組蛋白的乙?；?，參與表觀遺傳學(xué)調(diào)控[3]。但尚不清楚Nac-1的這些功能在NSPCs中是否存在。本課題組用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nac-1與c-Myc啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)Nac-1與c-Myc啟動(dòng)子區(qū)域有結(jié)合但結(jié)合能力不強(qiáng)(結(jié)果未給出)?？赡躈ac-1對(duì)c-Myc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控并非直接作用，而是借助蛋白-蛋白結(jié)合或組蛋白乙?；缺碛^遺傳學(xué)作用發(fā)揮功能，具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上可見(jiàn)，NSPCs中Nac-1的表達(dá)豐度高，隨分化而下降。Nac-1敲低的NSPCs增殖緩慢并趨向于分化。Nac-1可以調(diào)控c-Myc的轉(zhuǎn)錄水平。提示Nac-1是NSPCs維持自我更新所必需，Nac-1敲低引起的細(xì)胞功能變化可能是c-Myc的表達(dá)水平改變所引起。