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        上調(diào)miR-24對急性肺損傷幼齡大鼠炎癥反應的影響及作用機制

        2019-09-10 09:16:30岳彩虹曹海麗劉瑞敏
        關(guān)鍵詞:幼齡肺泡炎性

        趙 瑜,岳彩虹,曹海麗,劉瑞敏

        (1. 開封市兒童醫(yī)院呼吸科,河南開封 475000;2. 河南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫教研室,河南開封 475004)

        急性肺損傷(acute lung injury, ALI)指由膿毒癥、再灌注損傷、失血性休克、煙霧及有毒氣體吸入等因素引起的急性進行性呼吸衰竭[1],是幼兒出現(xiàn)急性呼吸衰竭癥狀的主要原因[2]。由于缺乏自我保護能力及意識,幼兒ALI發(fā)病率較高,而ALI可進一步發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征,患兒病死率接近50%[3]。現(xiàn)階段,臨床治療ALI多用呼吸支持療法配合鎮(zhèn)靜止痛藥,但不能從致病機理上阻止ALI的惡化。據(jù)報道,抑制ALI炎癥反應可顯著減輕肺部病理損傷,阻止ALI的進一步惡化[4]。研究表明,微小型RNA-24(microRNA-24, miR-24)可作為一類抗炎因子,顯著抑制炎癥因子產(chǎn)生并阻礙NF-κB信號通路的激活,從而減輕炎癥反應引起的病理組織損傷[5-8]。由于目前還沒有關(guān)于miR-24對ALI作用機制的報道,因此,本文通過上調(diào)miR-24,對其在ALI中的作用及機制進行了深入探究。

        1 材料與方法

        1.1 試劑脂多糖(LPS)購自美國Sigma;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher;HE染色試劑盒、Tunel細胞凋亡檢測試劑盒及BCA試劑盒購自上海碧云天;磷酸化核因子κB p65(nuclear factor κB p65, NF-κB p65)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(phosphorylation inhibitor of NF-κB, p-IκBα)及IκBα激酶(IκBα kinase, p-IKK)抗體購自美國Santa Cruz,實驗二抗購自北京中杉金橋;PCR引物利用Primer 3網(wǎng)站設(shè)計,購自北京六合華大;胎牛血清(FBS)購自美國Corning;青霉素、鏈霉素購自美國BI;DMEM/F-12+GlutaMAX培養(yǎng)基、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1α和IL-1β ELISA試劑盒購自美國Invirtrogen。

        1.2 幼齡大鼠分組及模型建立將幼齡大鼠(新生3~8 d)分為Control、ALI、ALI+miR-24 mimic mock及ALI+miR-24 mimic組,每組20只。ALI組大鼠腹腔注射LPS(3 mg/kg)建立ALI模型,ALI+miR-24 mimic mock及ALI+miR-24 mimic組大鼠建立ALI模型后,分別從尾靜脈注射miR-24 mimic mock及miR-24 mimic。miR-24 mimic mock是將miR-24 mimic基因隨機打亂后的序列,不與任何基因同源。Control組為空白對照,以等量生理鹽水替代LPS及miRNA進行處理。將各組大鼠飼養(yǎng)7 d后處死,并收集大鼠外周血及肺組織。稱量右肺干濕重,并對肺干濕重比進行計算。石蠟包埋肺組織,用于后期檢測。

        1.3 HE染色石蠟切片脫蠟,用蘇木精染色10 min,PBS洗滌3次,伊紅復染2 min,切片脫水后封片。于顯微鏡下觀察,細胞核為藍紫色,細胞質(zhì)及細胞外基質(zhì)為紅色。

        1.4 Tunel檢測石蠟切片脫蠟修復,用內(nèi)源性過氧化物酶封閉5 min,PBS洗滌3次,Tunel檢測液37 ℃避光孵育1 h。PBS洗滌3次,DAB顯色液避光顯色,蘇木精復染。于暗室顯微鏡觀察,凋亡細胞為棕色,正常細胞為藍色。

        1.5 Western blot實驗1.2中各組大鼠肺組織研磨勻漿后,加入RIPA裂解,提取組織蛋白。BCA試劑盒對組織蛋白定量并調(diào)平濃度。取各組蛋白30 μg,SDS-PAGE分離蛋白,半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,脫脂奶粉室溫封膜2 h,1.1中一抗4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育1 h,曝光顯色,GAPDH為內(nèi)參。

        1.6 細胞培養(yǎng)及分組大鼠肺泡巨噬細胞NR8383由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)提供。用含有150 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F-12+GlutaMAX培養(yǎng)細胞,培養(yǎng)箱條件為37 ℃、50 mL/L CO2,次日換液,細胞融合率達到85%以上時,以1×104/mL的濃度進行傳代。

        NR8383細胞分為Control、LPS、LPS+miR-24 mimic、LPS+pcDNA-IL-1α(pc-IL-1α)及LPS+miR-24 mimic+pc-IL-1α組。LPS組巨噬細胞利用1 μg/mL的LPS處理,LPS+miR-24 mimic、LPS+pc-IL-1α及LPS+miR-24 mimic+pc-IL-1α組細胞經(jīng)LPS處理后,分別或同時用miR-24 mimic及pc-IL-1α轉(zhuǎn)染,Control組細胞則加入等量空載。轉(zhuǎn)染步驟參考轉(zhuǎn)染試劑盒說明書,6 h后換液,繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

        1.7 熒光素酶報告實驗生物信息學分析miR-24與IL-1α的連續(xù)結(jié)合片段,PCR擴增將片段插入熒光素酶報告載體,構(gòu)建野生型IL-1α質(zhì)粒(IL-1α wt)。突變連續(xù)結(jié)合片段的核苷酸位點,構(gòu)建突變型IL-1α質(zhì)粒(IL-1α mut)。將miR-24 mimic與IL-1α wt或IL-1α mut共同轉(zhuǎn)染到NR8383細胞,培養(yǎng)24 h后,檢測各組細胞的熒光素酶活性。

        1.8 qRT-PCR實驗1.2中各組大鼠肺組織勻漿及1.6中各組細胞用Trizol進行裂解,于通風櫥中進行總RNA抽提。定量分析后,取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用實時定量PCR試劑盒通過實時熒光定量PCR儀進行定量并分析結(jié)果。結(jié)果計算方法:對照組2ΔCt平均值設(shè)為基準1,實驗組2ΔCt平均值與對照組2ΔCt平均值相比得到的2ΔΔCt值為mRNA的相對變化倍數(shù)。

        1.9 ELISA檢測1.2中各組大鼠外周血清及1.6中各組細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β濃度測定步驟參考Invirtrogen ELISA試劑盒說明書。避光顯色后,利用酶標儀檢測各組樣品A值,根據(jù)標準樣品曲線公式計算各樣品A值對應的蛋白濃度。

        2 結(jié) 果

        2.1 ALI及miR-24 mimic對幼齡大鼠肺組織中miR-24的影響與Control組比較,miR-24在ALI幼齡大鼠肺組織中的mRNA降低(P<0.01)。與ALI組比較,ALI+miR-24 mimic mock組無統(tǒng)計學差異,ALI+miR-24 mimic組中miR-24的mRNA表達升高(P<0.01,圖1)。

        圖1 各組中miR-24的mRNA水平

        Fig.1 The mRNA level of miR-24 in each group (n=6)

        與Control組比較,**P<0.01;與ALI組比較,##P<0.01。

        2.2 miR-24 mimic對ALI幼齡大鼠肺病理損傷的影響HE染色可見Control組幼齡大鼠肺泡形態(tài)規(guī)則、清晰且結(jié)構(gòu)完整。與Control組比較,ALI組幼齡大鼠肺泡結(jié)構(gòu)雜亂,大量炎性細胞及紅細胞充滿肺泡腔中。與ALI組比較,ALI+miR-24 mimic mock組無統(tǒng)計學差異,ALI+miR-24 mimic組中肺泡形態(tài)較為規(guī)則,炎性細胞及紅細胞減少(圖2)。

        圖2 各組幼齡大鼠肺病理變化

        Fig.2 The pathologic change of lung tissue in the infant rats of each group (×200,n=6)

        2.3 miR-24 mimic對ALI幼齡大鼠肺水腫的作用與Control組比較,ALI組幼齡大鼠肺干濕重比值增大(P<0.01)。與ALI組比較,ALI+miR-24 mimic mock組無統(tǒng)計學差異,ALI+miR-24 mimic組肺干濕重比值減小(P<0.01,圖3)。

        圖3 各組幼齡大鼠肺干濕重比值

        Fig.3 The ratio of lung wet/dry weight in the infant rats of each group (n=6)

        與Control組比較,**P<0.01;與ALI組比較,##P<0.01。

        2.4 miR-24 mimic對ALI幼齡大鼠肺組織細胞凋亡的影響與Control組比較,ALI組幼齡大鼠肺組織凋亡細胞百分比升高(P<0.01)。與ALI組比較,ALI+miR-24 mimic mock組無統(tǒng)計學差異,ALI+miR-24 mimic組凋亡細胞百分比降低(P<0.01,圖4)。

        2.5 miR-24 mimic對ALI幼齡大鼠炎癥反應的作用與Control組比較,ALI組幼齡大鼠外周血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平升高(P<0.01)。與ALI組比較,ALI+miR-24 mimic mock組無統(tǒng)計學差異,ALI+miR-24 mimic組中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平降低(P<0.01,圖5)。

        2.6 miR-24 mimic對ALI幼齡大鼠肺組織中NF-κB信號通路的影響與Control組比較,ALI組幼齡大鼠肺組織中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表達增多(P<0.01)。與ALI組比較,ALI+miR-24 mimic mock組無統(tǒng)計學差異,ALI+miR-24 mimic組中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表達減少(P<0.01,圖6)。

        圖4 各組幼齡大鼠肺組織細胞凋亡情況Fig.4 The apoptosis level of lung tissue in the infant rats of each group (n=6, ×400)與Control組比較,??P<0.01;與ALI組比較,##P<0.01。

        圖5 各組幼齡大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平比較

        Fig.5 The serum concentrations of TNF-α, IL-6, IL-1α and IL-1β in the infant rats of each group (n=6)

        與Control組比較,**P<0.01;與ALI組比較,##P<0.01。

        2.7 LPS及miR-24 mimic對大鼠肺泡巨噬細胞中miR-24的影響與Control組比較,miR-24在經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細胞中的mRNA水平降低(P<0.01)。與LPS組比較,LPS+miR-24 mimic mock組無統(tǒng)計學差異,LPS+miR-24 mimic組中miR-24的mRNA水平升高(P<0.01,圖7)。

        2.8 miR-24與IL-1α的靶向關(guān)系生物信息預測miR-24與IL-1α之間存在連續(xù)結(jié)合片段,同時,miR-24 mimic可降低IL-1α wt的熒光素酶活性(P<0.01,圖8),而對連續(xù)結(jié)合片段位點突變后的IL-1α mut沒有影響。

        2.9 miR-24 mimic及pc-IL-1α對經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細胞中炎癥反應的作用與Control組比較,LPS組大鼠肺泡巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平升高(P<0.01)。與LPS組比較,LPS+miR-24 mimic組中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平降低,LPS+pc-IL-1α組中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平升高(P<0.01,圖9)。與LPS+miR-24 mimic組比較,LPS+miR-24 mimic+pc-IL-1α組中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的水平升高。

        圖6 各組幼齡大鼠肺組織中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表達

        Fig.6 The expression of p-IKK, p-IκBα and NF-κB p65 in lung tissue of the infant rats in each group (n=6)

        與Control組比較,**P<0.01;與ALI組比較,##P<0.01。

        圖7 各組大鼠肺泡巨噬細胞中miR-24的mRNA水平比較

        Fig.7 The mRNA level of miR-24 in the rat alveolar macrophages of each group (n=6)

        與Control組比較,**P<0.01;與LPS組比較,##P<0.01。

        3 討 論

        miR-24是一類多功能調(diào)節(jié)因子。據(jù)報道,miR-24具有抗凋亡作用,可在急性肝衰竭中抑制肝細胞凋亡的發(fā)生[9];具有抑癌作用,可在骨肉瘤中顯著抑制癌細胞侵襲及遷移[10];具有抗炎作用,如在血管平滑肌細胞中,miR-24可通過阻礙NF-κB信號通路及降低炎癥因子TNF-α及IL-6表達水平,減輕糖尿病患者的血管病變[5];在軟骨組織中,miR-24可通過抑制炎癥反應改善模型大鼠骨關(guān)節(jié)炎組織損傷[6];在巨噬細胞中,過表達miR-24可抑制金黃色葡萄球菌誘導炎癥因子產(chǎn)生[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn),ALI可引起肺組織產(chǎn)生嚴重的炎癥反應,減輕炎癥反應可改善ALI造成的肺部病理損傷[4]。在ALI中,miR-24是否具有抗炎作用還有待進一步的研究。因此,本文通過上調(diào)miR-24,對其在ALI中的作用機制進行了深入研究。本研究首先檢測了miR-24在正常肺組織和ALI幼齡大鼠肺組織、正常大鼠肺泡巨噬細胞和經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細胞中的mRNA水平。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組分,常被用于ALI模型的建立,可誘導肺組織及細胞產(chǎn)生炎癥反應[11]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-24在ALI幼齡大鼠肺組織及LPS處理大鼠肺泡巨噬細胞中的mRNA水平降低,提示miR-24下調(diào)與ALI發(fā)生有關(guān)。

        圖8 miR-24與IL-1α的靶向關(guān)系

        Fig.8 The target relationship between miR-24 and IL-1α (n=6)

        與IL-1α wt組相比,**P<0.01。

        圖9 各組大鼠肺泡巨噬細胞上清中的TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β水平比較

        Fig.9 The concentrations of TNF-α, IL-6, IL-1α and IL-1β in the rat alveolar macrophage supernatant of each group (n=6)

        與Control組相比,**P<0.01;與LPS組相比,##P<0.01;與LPS+miR-24 mimic組相比,&&P<0.01。

        ALI可引起肺泡水腫、肺組織炎性細胞浸潤及組織細胞大量凋亡,抑制炎性細胞浸潤及抵抗細胞凋亡可減輕ALI引起的組織損傷[12]。研究發(fā)現(xiàn),miR-24具有抗炎作用,如在糖尿病患者血管病變中,miR-24可通過阻礙血管平滑肌細胞NF-κB信號通路的激活及抑制炎癥因子產(chǎn)生,減輕血管組織炎性浸潤現(xiàn)象[5];同時,miR-24具有抗凋亡作用,如在急性肝衰竭中,提高miR-24表達水平可降低肝細胞凋亡[9];在胃癌細胞中,miR-24可通過抑制促凋亡蛋白表達促進癌細胞增殖并阻礙細胞凋亡的發(fā)生[13]。本研究利用miR-24 mimic上調(diào)miR-24后發(fā)現(xiàn),miR-24可減少ALI模型幼齡大鼠肺泡內(nèi)的炎性細胞,降低肺干濕重比值及肺組織凋亡細胞百分比。同時,miR-24 mimic還可降低ALI幼齡大鼠血清及經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細胞上清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的濃度。TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β均為炎癥因子,可誘導肺泡巨噬細胞及呼吸道上皮細胞產(chǎn)生炎性趨化因子,刺激白細胞及薄壁細胞分泌黏附分子,促進肺組織炎癥反應的發(fā)生及發(fā)展[14]。同時,TNF-α和IL-1β可刺激其他細胞炎癥因子的產(chǎn)生,并誘導NF-κB信號通路過度激活,進一步推進炎癥反應的發(fā)展進程[15]。實驗結(jié)果說明,miR-24可減輕ALI導致的肺泡水腫、炎性細胞浸潤及肺組織細胞凋亡。

        NF-κB信號通路與炎癥反應密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在ALI中,NF-κB信號通路被高度激活,并促進肺部組織炎癥反應的發(fā)生[16]。有報道表明,miR-24有阻礙NF-κB核位移及其與DNA結(jié)合的作用[5]。在NF-κB信號通路激活過程中,需要由細胞外信號刺激IκBα激酶IKK活化為p-IKK,p-IKK磷酸化IκBα,使NF-κB p65從無活性的復合體中分離出來,位移至細胞核,從而誘導下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[17-18]。本文研究發(fā)現(xiàn),miR-24可減少ALI幼齡大鼠肺組織中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表達,說明miR-24可抑制ALI中NF-κB信號通路的激活,提示miR-24可能通過此途徑抑制ALI幼齡大鼠肺組織炎癥反應。

        IL-1α是IL-1存在形式之一,在組織炎癥反應及宿主早期固有免疫反應中發(fā)揮重要作用[19]。IL-1α具有雙重作用,除了通過與細胞表面受體結(jié)合發(fā)揮功能外,因其本身N段具有核定位位點,IL-1α還能直接調(diào)節(jié)基因的表達[20]。研究表明,IL-1α可促進IL-1R1依賴性促炎性因子的轉(zhuǎn)錄[21]。在肺組織中,IL-1α可在機體受到細菌病毒感染、吸入性損傷及氧化應激的條件下被應激及壞死細胞釋放,從而誘導炎癥反應及細胞凋亡的發(fā)生[22-25]。本研究利用生物信息預測發(fā)現(xiàn),miR-24-3p與IL-1α之間存在連續(xù)結(jié)合片段,通過熒光素酶報告實驗證明,miR-24-3p可靶向下調(diào)IL-1α。此外,研究結(jié)果表明,miR-24 mimic可降低經(jīng)LPS處理大鼠肺泡巨噬細胞上清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的濃度,而pc-IL-1α可升高這些炎癥因子,并減弱miR-24 mimic對炎癥因子的抑制作用,這提示miR-24可通過靶向下調(diào)IL-1α抑制ALI引起的炎癥反應。

        綜上所述,miR-24在ALI幼齡大鼠肺組織及LPS處理大鼠肺泡巨噬細胞中的mRNA水平降低,miR-24 mimic可上調(diào)miR-24,并減輕ALI導致的肺泡水腫、炎性細胞浸潤、炎癥因子高度表達及肺組織細胞凋亡。miR-24可抑制ALI中NF-κB信號通路的過度激活,同時靶向下調(diào)IL-1α。研究結(jié)果提示,miR-24可通過這兩種機制抑制ALI引起的炎癥反應,為ALI治療提供新的思路。

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