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        威寧火腿中微生物的分離鑒定及其耐受特性

        2019-09-10 08:56:02張詩意徐寶才李沛軍
        肉類研究 2019年8期
        關鍵詞:威寧假絲火腿

        張詩意,唐 楠,黃 攀,周 穎,徐寶才,李沛軍*

        (農產品生物化工教育部工程研究中心,合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院,安徽 合肥 230009)

        威寧火腿是貴州著名的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品,至今已有600多年的歷史。威寧火腿由高原瘦肉型良種“烏金豬”后腿加工而成,該豬腿部肌肉緊實,肌纖維質量高,為威寧火腿的加工提供了上乘的原料[1]。目前,威寧火腿仍延用家庭作坊式模式,于每年冬至后開始制作,采用自然發(fā)酵法生產。自然發(fā)酵中的微生物主要來源于原料肉及周圍環(huán)境,火腿中微生物種類復雜且易受到有害微生物的污染,因此產品質量受環(huán)境影響較大,嚴重時甚至會導致發(fā)酵過程的失敗,引起火腿腐敗變質[2]。

        在現(xiàn)代發(fā)酵肉制品加工工藝中,使用人工接種來控制生產過程已經成為一種趨勢[3]。與自然發(fā)酵相比,人工接種發(fā)酵不僅能保持產品質量穩(wěn)定、縮短發(fā)酵時間,還能保證產品安全性,統(tǒng)一生產標準,延長產品貨架期[4-5]。因此,分離、鑒定威寧火腿中的有益微生物就顯得至關重要。本研究以威寧火腿為研究對象,使用劃線培養(yǎng)法對其中的微生物進行分離并鑒定,同時對其耐鹽、耐亞硝酸鹽和耐低溫特性進行研究,以期揭示威寧火腿中優(yōu)勢微生物分布,為實現(xiàn)其工業(yè)化生產提供科學理論依據(jù);同時,可擴充我國肉用益生菌菌種庫。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 原料與試劑

        成熟期1 年的威寧火腿,購于威寧彝族回族苗族自治縣農貿市場,樣品置于放有冰袋的保溫箱中低溫運輸至實驗室。

        亞硝酸鈉 山東煙臺佳晶食品工業(yè)有限公司;氯化鈉 國藥集團化學試劑(上海)有限公司;革蘭氏染液 北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司;Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        甘露醇氯化鈉瓊脂(mannitol salt agar,MSA)液體培養(yǎng)基(牛肉浸膏5.0 g、?蛋白胨10.0 g、D-甘露醇10.0 g、氯化鈉75.0 g、酚紅1.5 mL、蒸餾水1 000 mL,pH 7.4f0.2,121 ℃滅菌20 min) 自制;MRS肉湯液體培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

        向上述液體培養(yǎng)基中各添加15.0 g/L瓊脂,得到相應的固體培養(yǎng)基。MSA固體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、麥芽汁固體培養(yǎng)基分別用于葡萄球菌、乳酸菌、酵母菌的分離培養(yǎng)。

        1.2 儀器與設備

        AC2-4S1生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司;H1650-W微量臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;721G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;YX280/15手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;BSD-250培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司;JY系列電子天平 上海衡平儀器儀表廠;Tanon 1600蛋白核酸檢測儀 上海天能科技有限公司;DYY-6D電泳儀 北京六一生物科技有限公司;SCIENTZ 09無菌均質器 寧波新芝生物科技股份有限公司;T100聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)基因擴增儀 美國Bio-Rad公司;C-HGFI Nikon Intensilight熒光顯微鏡 日本Nikon公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品處理

        在無菌條件下,用無菌刀從威寧火腿表層和內部1.0~2.0 cm處分別切取5 g樣品,放入盛有25 mL無菌生理鹽水的無菌袋中。將無菌袋放入無菌均質器中拍打30 s,得均質液備用。

        1.3.2 菌株的分離純化

        取上述均質液加入到無菌生理鹽水中適度稀釋后,吸取200 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基、MSA固體培養(yǎng)基和麥芽汁固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取單菌落,采用平板劃線法進行劃線培養(yǎng),重復操作直至獲得純種培養(yǎng)物。將純化后菌株接種于斜面培養(yǎng)基上,于4 ℃保存。

        1.3.3 菌種鑒定

        1.3.3.1 形態(tài)學觀察

        菌落形態(tài)特征分析:觀察并記錄菌落的表面形貌、色澤、透明度等特征。

        個體形態(tài)特征分析:挑取細菌菌體進行革蘭氏染色后鏡檢;酵母菌通過水浸片法觀察[6],記錄菌體細胞形態(tài)。

        1.3.3.2 DNA序列鑒定

        參照細菌、酵母基因組DNA提取試劑盒說明書,提取細菌、酵母基因組DNA,并于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。細?6S rRNA基因采用通用引物進行擴增:上游引物27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’),下游引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。酵母菌內部轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列擴增通用引物為:上游引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’),下游引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[7-8]。PCR反應體系(50 μL)為:Taq PCR Master Mix 25 μL、模板DNA 2 μL、引物各2 μL、無菌ddH2O 19 μL,混勻30 s。PCR反應條件:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性30 s,45 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,進行30 個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。

        PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫,使用BLAST對基因的同源性進行分析,獲取與目的基因序列同源性較高不同種序列。使用MEGA-X軟件構建Neighbor-Joinging系統(tǒng)發(fā)育樹[9-10],同時綜合考慮菌株菌落特征和菌體形態(tài),確認菌株名稱。

        1.3.4 微生物特性研究

        1.3.4.1 耐鹽特性

        吸取活化3 代后的菌液200 μL,分別接種于NaCl質量分數(shù)為3%、6%和9%的選擇性液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng),以未接種培養(yǎng)基作為空白對照。細菌、酵母經10 h培養(yǎng)后,測定培養(yǎng)液在600 nm波長處的光密度(optical density,OD600nm)[11]。

        1.3.4.2 耐亞硝酸鹽特性

        吸取活化3 代后的菌液200 μL,接種于NaNO2添加量分別為0、150 mg/kg的選擇性液體培養(yǎng)基中[12],37 ℃培養(yǎng),其中前者為對照組。細菌、酵母經10 h培養(yǎng)后測定培養(yǎng)液的OD600nm。耐受系數(shù)定義為實驗組OD600nm與對照組OD600 nm之比[13]。

        1.3.4.3 耐低溫特性

        吸取活化3 代后的菌液200 μL,接種于選擇性液體培養(yǎng)基中,于4 ℃條件下培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)組設為對照組。細菌、酵母經10 h培養(yǎng)后測定培養(yǎng)液的OD600nm。耐受系數(shù)為實驗組OD600nm與對照組OD600nm之比。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        使用Statistix 8.1軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析,使用Origin 2017軟件作圖。每個實驗重復3 次,結果表示為平均值±標準差。

        2 結果與分析

        2.1 威寧火腿中微生物的分離與鑒定

        對威寧火腿中的優(yōu)勢微生物進行分離純化,共得到10 株菌,分別編號為WN1~WN10,通過形態(tài)學分析和DNA序列分析,鑒定威寧火腿中微生物的種類。

        2.1.1 形態(tài)學分析

        表1 威寧火腿中分離菌株的菌落特征及菌體形態(tài)Table 1 Colony and cell morphology of the isolated strains

        由表1可知:分離純化得到的8 株細菌均為革蘭氏陽性(G+)菌,菌落形態(tài)圓整,邊緣整齊,成對、成堆或成葡萄狀排列;2 株酵母菌菌落大而厚,表面光滑,呈卵圓形,均有酒香。

        圖1為細菌革蘭氏染色鏡檢圖像,圖2為酵母菌鏡檢圖像。

        2.1.2 DNA序列鑒定

        提取獲得各菌株基因組DNA后進行PCR擴增。由圖3可知,樣品WN1~WN8擴增產物的分子質量約為1 500 bp,樣品WN9、WN10擴增產物的分子質量約為500 bp,且擴增條帶清晰、明亮可見。所有條帶分子質量大小符合理論預期。

        利用N C B I數(shù)據(jù)庫,對分離菌株的D N A序列進行BLAST分析,確定菌種鑒定結果。由表2可知,威寧火腿的10 個分離菌株中包括4 株馬胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、2 株木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、2 株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、1 株變平滑假絲酵母菌(Candida metapsilosis)和1 株近平滑假絲酵母菌(Candida parapsilosis)。

        對比國內三大火腿,宣威火腿最顯著的特點是表面存在大量耐鹽的G+菌,其優(yōu)勢菌群包括葡萄球菌和微球菌[14]。黃艾祥[15]發(fā)現(xiàn),云南干腌火腿中的優(yōu)勢細菌主要有馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和變異微球菌等,其中葡萄球菌是云腿加工過程中的優(yōu)勢菌。樣品中檢出的酵母菌數(shù)量相對較少,經分離鑒定主要有紅酵母、德巴利酵母、漢遜酵母、誕沫假絲酵母、彎假絲酵母及隱球酵母。蔣云升等[16]研究發(fā)現(xiàn),在如皋火腿的自然發(fā)酵過程中,球菌、桿菌、酵母菌是優(yōu)勢菌群。余翔[17]研究發(fā)現(xiàn),在現(xiàn)代化發(fā)酵技術生產的金華火腿中,細菌的優(yōu)勢種為乳酸菌,其次為葡萄球菌;在真菌方面,內部占優(yōu)勢的酵母菌主要是歐諾比假絲酵母、白色布勒擲孢酵母等。國外著名腌制火腿中,Jamon Iberico火腿發(fā)酵成熟過程中的優(yōu)勢菌包括葡萄球菌屬和微球菌屬,從Parma火腿表面樣品中可以分離出乳球菌屬細菌,從內部樣品可以分離出耐鹽菌[18-19]。Virgili等[20]從Italian火腿表面分離得到12 株酵母菌,經鑒定屬于德巴利酵母屬、假絲酵母屬和漢森酵母屬。

        本研究分離鑒定得到的大多數(shù)微生物在上述國內外火腿(宣威火腿、如皋火腿、金華火腿、Jamon Iberico火腿、Parma火腿、Italian火腿)中較為常見,如馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌和乳酸片球菌。但也有幾種微生物,如變平滑假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌,報道比較少,這可能是由于在不同生產環(huán)境下,不同火腿中的微生物種類存在差異。2004年,近平滑假絲酵母菌被確立為種水平上的新分類單元[21]。梁慧等[22]從傳統(tǒng)臘魚中分離篩選得到2 株產香酵母,其中1 株為近平滑假絲酵母菌。郭壯等[23]從生膜牛肉醬中分離到4 株變平滑假絲酵母菌,并且發(fā)現(xiàn)它們能使牛肉醬產膜,其在火腿中的作用有待進一步研究。

        2.2 威寧火腿中分離微生物的特性研究

        從分離得到的5 種菌中各選擇1 株代表菌株(WN1、WN5、WN7、WN9、WN10),開展耐鹽、耐亞硝酸鹽和耐低溫特性研究。

        2.2.1 耐鹽特性研究

        耐鹽能力是選擇發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的一個重要因素,對發(fā)酵肉制品的感官質量和生物安全性有重要影響。篩選出的菌株要求能夠在至少6%的食鹽含量下正常生長[24-25]。因此,研究鹽含量對5 株菌生長的影響。

        由圖4可知,隨著培養(yǎng)基NaCl含量的增加,各菌株的生長量均呈下降趨勢。各菌株在NaCl含量為3%時生長量最大,表明高NaCl含量會抑制菌株的生長。其中,乳酸片球菌WN7在6% NaCl含量下生長量顯著下降(P<0.05),降幅超過60%。當NaCl含量增加到9%時,木糖葡萄球菌WN5基本停止生長,馬胃葡萄球菌WN1、變平滑假絲酵母菌WN9和近平滑假絲酵母菌WN10的生長量有所下降但仍能生長,故耐鹽性較好。

        潘明[26]從如皋火腿中分離、純化得到耳式葡萄球菌、表皮葡萄球菌和木糖葡萄球菌3 種葡萄球菌,結果表明,適當濃度的NaCl能夠促進3 種葡萄球菌的生長,其中耳式葡萄球菌的耐鹽性最強,當NaCl含量達到8%時才對其有抑制作用,木糖葡萄球菌的耐鹽性稍差,但在12% NaCl含量下依然能夠生長,其耐鹽特性超過馬胃葡萄球菌WN1。

        2.2.2 耐亞硝酸鹽特性研究

        肉制品生產過程中,亞硝酸鈉是重要添加劑。肉類工業(yè)中,通常要求菌株在150 mg/kg的亞硝酸鈉條件下可良好生長[27]。因此,研究添加亞硝酸鈉對5 株菌生長的影響。

        由圖5可知,在亞硝酸鈉含量為150 mg/kg的培養(yǎng)基中,5 株菌均可生長。其中,馬胃葡萄球菌WN1的耐受系數(shù)接近于1.00,表明其生長幾乎不受亞硝酸鹽添加的影響,耐亞硝酸鹽能力顯著高于其他菌株(P<0.05);木糖葡萄球菌WN5、乳酸片球菌WN7和近平滑假絲酵母菌WN10在亞硝酸鈉添加量為150 mg/kg時生長有所抑制,但耐受系數(shù)均能達到0.70以上,耐亞硝酸鹽能力次之;而變平滑假絲酵母菌WN9的耐受系數(shù)最低(0.62),對亞硝酸鹽的耐受力最差。

        李欣蔚等[28]研究劍門火腿中葡萄球菌、乳酸菌在亞硝酸鹽添加量為150 mg/kg時的生長量,結果表明,5 株菌均具有一定的耐亞硝酸鹽特性,其中葡萄球菌(S-1、S-2和S-3)對亞硝酸鹽具有較強的耐受性,而乳酸菌(L-1和L-2)的耐受性相對較弱。潘明[26]從如皋火腿分離、純化得到的耳式葡萄球菌、表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌和德巴利漢遜酵母均有較好的耐亞硝酸鹽特性,其中葡萄球菌耐亞硝酸鹽性最好。與本研究結果一致。

        2.2.3 耐低溫特性研究

        溫度在發(fā)酵肉制品的生產過程中起著至關重要的作用。通常情況下,發(fā)酵肉制品的腌制溫度為4 ℃,最適發(fā)酵溫度為25~30 ℃[29]。此外,中式火腿制作周期較長,其腌制工序一般不少于40 d。因此,本研究探討低溫(4 ℃)對5 株菌生長的影響。

        由圖6可知,在培養(yǎng)溫度降低至4 ℃時,5 個菌株均能維持一定的生長量,但不同菌株受低溫的影響程度存在顯著差異(P<0.05)。3 株細菌的耐受系數(shù)分別為0.40、0.04和0.12,故細菌對低溫的耐受力依次為馬胃葡萄球菌WN1>乳酸片球菌WN7>木糖葡萄球菌WN5,其中馬胃葡萄球菌WN1的耐受系數(shù)明顯高于其他細菌,耐低溫性最好。在4 ℃培養(yǎng)溫度下,變平滑假絲酵母菌WN9和近平滑假絲酵母菌WN10的耐受系數(shù)最高,分別為0.55和0.60,表明其在低溫條件下依然能較好地生長。

        劉曉強[30]從云南火腿中分離得到1 株變異微球菌和2 株木糖葡萄球菌,這3 株菌均能耐受6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鹽。用MRS培養(yǎng)基分離得到2 株戊糖片球菌和2 株清酒乳桿菌,也均能耐受6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鹽,但是均不耐低溫。本研究篩選得到的木糖葡萄球菌WN5能耐受6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鹽但不耐低溫,與劉曉強[30]研究結果相一致;而乳酸片球菌WN7與其相比耐鹽性較差。

        3 結 論

        從威寧火腿中分離出10 株微生物,經過菌落特征、個體形態(tài)分析以及DNA序列鑒定,最終確定為5 種菌,分別為馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、乳酸片球菌、變平滑假絲酵母和近平滑假絲酵母。其中,馬胃葡萄球菌WN1、變平滑假絲酵母菌WN9和近平滑假絲酵母菌WN10耐鹽性較好,乳酸片球菌WN7耐鹽性稍差,而木糖葡萄球菌WN5在9% NaCl含量下幾乎不能生長。馬胃葡萄球菌WN1對亞硝酸鈉含量為150 mg/kg的培養(yǎng)基耐受力最好,平滑假絲酵母菌WN9的耐受力最差。在4 ℃培養(yǎng)溫度下,變平滑假絲酵母菌WN9和近平滑假絲酵母菌WN10的耐低溫能力顯著高于其他菌株,細菌中馬胃葡萄球菌WN1的耐受系數(shù)最高。因此,馬胃葡萄球菌WN1和近平滑假絲酵母菌WN10耐鹽、耐亞硝酸鹽和耐低溫能力較好,能夠適應不同外部環(huán)境。

        本研究揭示了威寧火腿中細菌和酵母的組成及特性,擴充了肉制品有益菌菌種庫,為后續(xù)肉制品發(fā)酵劑的本土化研究和開發(fā)提供了理論基礎。而在威寧火腿發(fā)酵過程中,微生物對火腿風味等品質的影響還有待進一步研究。

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