柳景紅　劉登義　陳振中　李樂(lè)平　曹建雄

〔摘要〕 目的 觀察桃紅四物湯對(duì)急性下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor-necrosisfactor-α，TNF-α）與白介素- 6（interleukin-6，IL-6）水平的影響。方法 將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（A）、DVT模型（B）、桃紅四物湯（C）、阿司匹林（D）4組，每組20只。A組：只開(kāi)腹，不結(jié)扎股靜脈，再灌胃生理鹽水;B組：予以結(jié)扎近心端左股靜脈造模后灌胃生理鹽水;C組：予以結(jié)扎近心端左股靜脈造模后桃紅四物湯灌胃給藥;D組：予以結(jié)扎近心端左股靜脈造模后灌胃阿司匹林;7 d后停止灌胃，分別于術(shù)前、術(shù)后第1天、7天用放射性免疫分析法測(cè)定各組血清中TNF-α、IL- 6 的水平，并進(jìn)行組間比較。結(jié)果 術(shù)后第1天、7天，與A組比較，B組血清IL-6和TNF-α水平遞增（P<0.05），3個(gè)時(shí)點(diǎn)間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與B組比較，C組IL-6和TNF-α水平均降（P<0.05）。結(jié)論 DVT大鼠經(jīng)桃紅四物湯治療后其血清IL-6和TNF-α水平均明顯降低，提示桃紅四物湯對(duì)深靜脈血栓的防治療效較好，具有抗凝聚、提高纖溶活性的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 桃紅四物湯;深靜脈血栓;白介素-6;腫瘤壞死因子-α

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5;R543.6? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.01.008

Effect of Taohong Siwu Decoction on Serum Levels of IL-6 and TNF-α in a Rat

Model of Acute Deep Venous Thrombosis

LIU Jinghong， LIU Dengyi， CHEN Zhenzhong， LI Leping， CAO Jianxiong*

（The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Taohong Siwu Decoction on the serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in rats with acute deep venous thrombosis （DVT） of the lower extremities. Methods Eighty male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into four groups： sham-operated group （group A）， DVT model group （group B）， Taohong Siwu Decoction group （group C）， and aspirin group （group D）， with 20 rats in each group. The rats in group A were given open surgery without femoral vein ligation， and then given intragastric administration of saline. The rats in group B were given proximal ligation of the left femoral vein to establish a DVT model， and then given intragastric administration of saline. The rats in group C were given intragastric administration of Taohong Siwu Decoction after proximal ligation of the left femoral vein for establishing the DVT model. The rats in group D were given intragastric administration of aspirin after proximal ligation of the left femoral vein for establishing the DVT model. The intragastric administration in the rats of all groups was withdrawn 7 days later. The serum levels of TNF-α and IL-6 in the four groups were measured by radioimmunoassay before and at 1 and 7 days after operation， and were compared between the four groups. Results Group B had significantly higher serum levels of IL-6 and TNF-α than group A at 1 and 7 days after operation （P<0.05）， and the two proinflammatory cytokines were significantly different between the three time points （P<0.05）. However， group C had significantly reduced serum levels of IL-6 and TNF-α compared with group B after operation （P<0.05）. Conclusion The serum levels of IL-6 and TNF-α in SD rats with acute DVT decrease significantly after intragastric administration of Taohong Siwu Decoction， suggesting that Taohong Siwu Decoction has good efficacy in preventing and treating DVT， with anticoagulant and fibrinolytic activity.

〔Keywords〕 Taohong Siwu Decoction; deep venous thrombosis; interleukin-6; tumor necrosis factor-α

靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）是臨床三大血栓性疾病（心肌梗死、缺血性腦卒中及靜脈血栓）之一，也是臨床上最常見(jiàn)的靜脈疾病之一[1]。急性下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）是臨床常見(jiàn)的外周血管疾病，若治療不及時(shí)，易繼發(fā)致命的肺栓塞和慢性靜脈瓣功能不全。目前DVT的臨床治療主要以中西醫(yī)結(jié)合為主[2]。而中醫(yī)藥治療DVT不良反應(yīng)小，安全性高，對(duì)促進(jìn)再通和側(cè)支循環(huán)的建立都有可靠療效，可以彌補(bǔ)西藥治療溶栓抗凝治療帶來(lái)的易致出血的不良反應(yīng)，以及其量效關(guān)系不確切的不足[3]。桃紅四物湯為中醫(yī)傳統(tǒng)活血化瘀經(jīng)典方劑之一， 源自于清·吳謙的《醫(yī)宗金鑒》， 由桃仁、紅花、當(dāng)歸、白芍、熟地黃、川芎6味中藥組成，具有活血化瘀、養(yǎng)血補(bǔ)血的雙重功效。全方養(yǎng)血而不滯血， 活血而不破血， 補(bǔ)中有行， 破中有收， 諸藥合用， 達(dá)到活血行氣、扶正祛邪之功效， 在現(xiàn)代中醫(yī)臨床被廣泛應(yīng)用， 且有較好療效。近幾年來(lái)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)炎癥與血栓形成之間存在著密切的聯(lián)系，一方面炎癥促進(jìn)高凝狀態(tài)，另一方面血栓形成中的物質(zhì)也可引起炎癥。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）與白介素-6（interleukin-6，IL-6）是重要的早期炎癥因子。本研究采用桃紅四物湯對(duì)大鼠DVT模型進(jìn)行干預(yù)后，試圖通過(guò)檢測(cè)血清IL-6和TNF-α水平的變化，研究桃紅四物湯治療深靜脈血栓的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治深靜脈血栓形成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用體質(zhì)量（250±20）g的雄性清潔級(jí)SD大鼠80只，16周齡，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2012-0004。隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，每組20只。

1.2? 藥物試劑與儀器

IL-6和TNF-α ELISA 試劑盒均購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司（IL-6試劑盒產(chǎn)品編：kt40133，TNF-αELISA 試劑盒產(chǎn)品編號(hào)：kt30484）。其他相關(guān)儀器由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。桃紅四物湯按照《醫(yī)宗金鑒》的配比：桃仁20 g，紅花20 g，當(dāng)歸20 g，熟地黃20 g，赤芍20 g，川芎10 g。依據(jù)成人（60 kg）與動(dòng)物體表面積換算公式得出大鼠等效劑量為7.56 g/kg，桃紅四物湯3次煎煮藥液混合并濃縮至含生藥1.1 g /mL，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥煎劑室提供。阿司匹林腸溶片（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20130078，安徽仁濟(jì)制藥有限公司提供）以生理鹽水配成0.075 mg/mL。

1.3? 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1? 造模? 各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后開(kāi)始手術(shù)造模，予以大鼠腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉后，仰臥位固定，常規(guī)消毒鋪巾，沿左側(cè)下肢股靜脈走行切開(kāi)皮膚約4.5 cm，暴露、分離左側(cè)股靜脈，抽取股動(dòng)脈血液做檢測(cè)標(biāo)本。A、B、C 3組用4號(hào)絲線于暴露的股靜脈近心端結(jié)扎股靜脈，結(jié)扎線以下1 cm處放置微型血管夾，6 h后拆除結(jié)扎線及血管夾，造模完成，無(wú)菌縫線縫合手術(shù)創(chuàng)口，D組（假手術(shù)組）大鼠不予結(jié)扎，只將絲線置于血管處，6 h后無(wú)菌縫線縫合手術(shù)創(chuàng)口。

1.3.2?; 干預(yù)措施? 造模術(shù)后6 h，肉眼見(jiàn)模型大鼠左下肢腫脹，行彩色多普勒超聲檢查大鼠左下肢靜脈血栓形成，則提示造模成功，造模成功后，立即實(shí)施干預(yù)措施。假手術(shù)組（A組）20只，術(shù)后6 h灌胃20 mL/kg生理鹽水;模型組（B組）20只，術(shù)后6 h立即灌服20 mL/kg生理鹽水;桃紅四物湯組（C組）20只，術(shù)后6 h立即桃紅四物湯濃縮液灌胃給藥，劑量20 mL/kg;阿司匹林組（D組）20只，術(shù)后6 h立即灌服阿司匹林腸溶片懸濁液20 mL/kg。以上灌服方法均為每日2 次，持續(xù)時(shí)間為一周。

1.3.3? IL-6和TNF-α水平檢測(cè)? 術(shù)后第1天、7天取大鼠動(dòng)脈血采用ELISA 法檢測(cè)血清中IL-6和TNF-α水平，具體操作均按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD）值。

1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以“x±s”表示，同時(shí)點(diǎn)4組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn);同組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1? 彩色多普勒超聲檢查DVT組大鼠模型

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡，建模前彩色多普勒超聲檢查提示所有大鼠的左下肢深靜脈通暢、無(wú)DVT發(fā)生;術(shù)后1 d行彩色多普勒超聲檢查提示DVT組大鼠均有左下肢DVT 形成。

2.2? 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)的血清IL-6和TNF-α水平

術(shù)前假手術(shù)組、模型組、桃紅四物湯組與阿司匹林組的血清IL- 6水平和TNF-α術(shù)前水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;但術(shù)后第1天、7天，與假手術(shù)組比較，模型組血清IL- 6和TNF-α水平遞增（P<0.05）;除假手術(shù)組外其余3組組內(nèi)3個(gè)時(shí)點(diǎn)間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組IL- 6、TNF-α水平均降低（P<0.05）。見(jiàn)表1、表2。

3 討論

DVT的形成系指血液在深靜脈腔內(nèi)不正常地凝結(jié)，阻塞靜脈管腔，從而導(dǎo)致靜脈回流障礙，是創(chuàng)傷、手術(shù)、癱瘓等之后常發(fā)生的并發(fā)癥，常好發(fā)于下肢。若治療不及時(shí)，易繼發(fā)致命的肺栓塞和慢性靜脈瓣功能不全?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[4-7]表明，炎癥反應(yīng)與血栓形成之間存在著密切的聯(lián)系，一方面炎癥促進(jìn)高凝狀態(tài)，另一方面血栓形成中的物質(zhì)也可引起炎癥。IL-6與TNF-α是重要的早期炎癥因子，與創(chuàng)傷后DVT形成[8-9]、創(chuàng)傷后感染[10]、創(chuàng)傷后預(yù)后有著密切聯(lián)系。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DVT是各種原因致瘀血瘀阻脈中，歷代醫(yī)家多采用活血化瘀法治療DVT[11]，在臨床上我們發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯治療效果甚佳。亦有實(shí)驗(yàn)研究[12]表明，桃紅四物湯能顯著延長(zhǎng)大鼠體內(nèi)凝血時(shí)間和血栓形成時(shí)間，能顯著降低血瘀大鼠全血比黏度、血漿比黏度及血清比黏度，具有較好的活血化瘀作用。桃紅四物湯為中醫(yī)活血化瘀經(jīng)典方劑之一， 源自于清·吳謙的《醫(yī)宗金鑒》，由四物湯衍生而來(lái)，共有藥物6味，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、赤芍、熟地黃、川芎組成，具有活血化瘀、養(yǎng)血補(bǔ)血的雙重功效。全方養(yǎng)血而不滯血， 活血而不破血， 補(bǔ)中有行， 破中有收， 諸藥合用， 達(dá)到活血行氣、扶正祛邪之功效， 在現(xiàn)代中醫(yī)臨床被廣泛應(yīng)用， 且有較好療效。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎股靜脈以建立大鼠DVT模型，且用彩色多普勒超聲檢查提示大鼠左下肢DVT建立成功后，立即實(shí)施干預(yù)措施。術(shù)后第1天、7天，與A組比較，B組血清IL-6和TNF-α水平遞增（P<0.05），3個(gè)時(shí)點(diǎn)間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明結(jié)扎術(shù)導(dǎo)致了DVT的形成及炎癥因子的釋放，炎癥因子IL-6和TNF-α在DVT形成中具有重要作用;與B組比較，C組IL-6、TNF-α水平均降低（P<0.05），說(shuō)明桃紅四物湯能下調(diào)TNF-α，IL-6炎癥因子的水平，其機(jī)制主要可能是桃紅四物湯藥能有效地抑制TNF-α和IL-6的失控性釋放，清除體內(nèi)炎癥介質(zhì)，并可能在一定程度上改善微循環(huán)、改善血流動(dòng)力學(xué)、減少炎癥滲出，促進(jìn)炎癥吸收，從而抑制了DVT 的進(jìn)一步發(fā)展。

綜上，桃紅四物湯能明顯改善炎癥因子IL-6、TNF-α的血清學(xué)水平，在一定程度上揭示了其防治深靜脈血栓的作用機(jī)制，為臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。深化了中醫(yī)藥養(yǎng)血活血法治療DVT的研究，為在中醫(yī)辨證論治理論的指導(dǎo)下，應(yīng)用養(yǎng)血活血等方藥對(duì)深靜脈血栓的防治提供較為客觀、科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

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