韓潔茹 解穎 陳飛 李富震 姜德友

摘要?目的：觀察資生腎氣丸對痛風大鼠血清中谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及大鼠滑膜核因子κΒ（NF-κΒ）的表達水平的影響，探討資生腎氣丸防治痛風的作用機制。方法：將105只SD大鼠隨機分為空白組（BG）、模型組（MG）、中藥對照組（CMCG）、西藥對照組（WMCG）及資生腎氣丸復方低、中、高觀察組（ZSD-L/M/HG）7組，每組15只。采用尿酸鈉（MSU）聯(lián)合氧嗪酸鉀（OXO）注射建立大鼠痛風模型，檢測各組大鼠血清中GSH、GSH-Px含量，檢測大鼠滑膜組織中NF-κΒ含量。結果：MG和BG的GSH、GSH-Px和NF-κΒ含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;WMCG、ZSD-MG、ZSD-HG的GSH、GSH-Px和NF-κΒ含量與MG比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;ZSD-MG與CMCG比較，GSH、GSH-Px和NF-κΒ含量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與WMCG比較，GSH、GSH-Px和NF-κΒ含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：資生腎氣丸可調(diào)控痛風大鼠GSH、GSH-Px和NF-κΒ的表達，對痛風具有防治作用。

關鍵詞?痛風;資生腎氣丸;中藥復方;GSH;GSH-Px;NF-κΒ;大鼠;實驗研究

Effects of Zisheng Shenqi Pills on Expression of GSH and NF-κΒ in Gouty Rats

Han Jieru，Xie Ying，Chen Fei，Li Fuzhen，Jiang Deyou

（Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of Zisheng Shenqi Pills on expression of GSH，GSH-Px and NF-κΒ in gouty rats and to explore the mechanism of Zisheng Shenqi Decoction in the treatment of the gout.Methods：A total of 105 rats were randomly divided into 7 groups：a blank control group，a model group，a Chinese medicine control group，a western medicine control group，high，medium，low dosage Zisheng Shenqi Pills group，with 15 rats in each group.The uric acid sodium and oxygen polybenzoxazines potassium were used to induce rat gouty arthritis model.The concentration of serum GSH and GSH-Px and the contents of synovial NF-κΒ in rats were detected.Results：The differences of GSH，GSH-Px and NF-κΒ level between the model group and the blank group had statistical significance（P<0.01）.The expression of GSH，GSH-Px and NF-κΒ in model group was also apparently different from that in western medicine control group，high and medium dosage Zisheng Shenqi Pills group，and the differences had statistical significance（P<0.01）.The expression of GSH，GSH-Px and NF-κΒ in medium dosage herbal group was apparently different from that in Tongfengshu control group（P<0.05），and had not apparently difference from Colchicine control group（P>0.05）.Conclusion：Zisheng Shenqi Pills can control the expression of GSH，GSH-Px and NF-κΒ in gout rats.It has certain curative effect with gout.

Key Words?Gouty arthritis; Zisheng Shenqi Pills; Chinese medicine compound; GSH; GSH-Px; NF-κΒ; Experimental rats; Experimental studies

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.017

痛風是一組嘌呤代謝紊亂所致的代謝紊亂疾病，其主要臨床特點是體內(nèi)尿酸產(chǎn)生過多或排泄尿酸減少，引起血尿酸升高，形成高尿酸血癥以及痛風性關節(jié)炎等[1]。研究結果表明[2]，痛風源于飲食，但其致病因素眾多，與遺傳、年齡、性別、精神因素、環(huán)境因素、地區(qū)分布等均有密切聯(lián)系。痛風對患者身體危害極大，發(fā)作主要以局部關節(jié)劇烈疼痛為主要表現(xiàn)，長期患病得不到控制的痛風患者，可能會引起腎臟損害，對身體危害極大，患者生命質(zhì)量降低，經(jīng)濟負擔加重。對于痛風的治療，西藥能有效地控制其急性發(fā)作，但不良反應較多[3]，因此選用安全有效的中醫(yī)中藥是治療痛風的必然趨勢。本課題組總結多年的臨床經(jīng)驗，提出中醫(yī)經(jīng)典方劑——資生腎氣丸中藥復方治療痛風，前期動物實驗[4-5]已驗證，資生腎氣丸中藥復方具有抗炎及鎮(zhèn)痛作用。本實驗就資生腎氣丸中藥復方對痛風大鼠模型血清中氧化應激相關指標谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和滑膜組織轉錄因子核因子κΒ（NF-κΒ）的影響展開研究，為資生腎氣丸中藥復方的臨床應用提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?健康雄性SD大鼠105只，體質(zhì)量（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心提供[合格證號SCXK（黑）2013004]，實驗室常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)。

1.1.2?藥物?資生腎氣丸中藥復方湯劑（熟地黃、澤瀉、山茱萸、懷牛膝、牡丹皮、萆薢、山藥、車前子、土茯苓等，由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)藥制劑科提供，以中藥原液0.94、1.88、3.76 mL濃縮為實驗藥液，經(jīng)高溫消毒后封瓶，置于冰箱中保存?zhèn)溆?。秋水仙堿片（云南昊邦制藥有限公司，批號170126）：配置成0.05 mg/mL秋水仙堿混懸液;痛風舒片（湖北綠金子藥業(yè)有限責任公司，批號170705）：配置成0.1 g/mL痛風舒片混懸液。均置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3?試劑與儀器?痛風造模試劑產(chǎn)品：氧嗪酸鉀鹽（批號CAS2207-75-2，Sigma），微晶尿酸鈉結晶（批號CAS1198-77-2，Sigma）;比色法檢測試劑產(chǎn)品：GSH和GSH-Px試劑盒（南京建成，批號201801）;WB檢測試劑產(chǎn)品：NFkB羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP均購自碧云天公司，NF-κB p65 antibody為Boster產(chǎn)品。儀器：紫外可見光分光光度計（上海佑科，型號：UV752型），酶標儀（美國BIOTEK，型號：ELX-800型），WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一）。

1.2?方法

1.2.1?分組及模型制備?大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為空白組（BG）、模型組（MG）、中藥對照組（CMCG）、西藥對照組（WMCG）、資生腎氣丸高劑量組（ZSD-HG）、資生腎氣丸中劑量組（ZSD-MD）、資生腎氣丸低劑量組（ZSD-LG）7組，每組15只。除BG外，其他各組均按以下方法造模[6]：用3%OXO溶液按每100 g大鼠注射1 mL的劑量進行腹腔內(nèi)注射，15 min后用BD針以30°～40°角度插入大鼠左側膝關節(jié)關節(jié)腔，注射10%MSU溶液0.2 mL。BG只采用BD針將0.2 mL生理鹽水注入膝關節(jié)關節(jié)腔內(nèi)。

1.2.2?干預方法?大鼠灌胃溶液以每100 g/mL為標準，BG和MG均用生理鹽水灌胃，WMCG和CMCG分別用秋水仙堿溶液和痛風舒片溶液灌胃，ZSD-LG、ZSD-MG、ZSD-HG分別給予相應濃度的資生腎氣丸原液灌胃。2次/d，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后造模。

1.2.3?檢測指標與方法?造模后4 h后，各組大鼠眼眶取血，4 ℃ 4 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測。大鼠取血后處死，解剖大鼠右膝關節(jié)，切取受試關節(jié)的滑膜組織，迅速置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 17.3統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，正態(tài)分布且方差相齊，則多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗;若條件不滿足則采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?各組大鼠血清GSH及GSH-Px含量比較?MG血清GSH和GSH-Px含量較BG明顯降低（P<0.01），除ZSD-LG各觀察組經(jīng)治療后血清GSH和GSH-Px含量與MG比較均顯著升高（P<0.05），但仍低于BG;與MG比較，ZSD-LG血清中GSH含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而GSH-Px升高，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與MG比較，ZSD-HG和ZSD-MG組血清中GSH和GSH-Px的含量明顯升高（P<0.01）;而CMCG、ZSD-LG血清中GSH和GSH-Px含量與WMCG比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;ZSD-MG組血清GSH、GSH-Px含量與CMCG比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;WMCG血清GSH和GSH-Px含量與ZSD-HG、ZSD-MG比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且ZSD-MG和ZSD-HG組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2?大鼠滑膜組織NF-κB含量?在滑膜組織中，NF-κB在MG中表達上調(diào)，各觀察組經(jīng)治療后NF-κB表達下降，蛋白印記表現(xiàn)見圖1。從圖1可以看出：與BG比較，MGNF-κB的表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與MG比較，ZSD-LG經(jīng)治療后滑膜NF-κB表達下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;ZSD-HG、ZSD-MG組、WMCG與MG比較，滑膜中NF-κB表達顯著下降（P<0.01）;CMCG與MG比較，滑膜中NF-κB表達下降（P<0.05）;而CMCG、ZSD-LG滑膜中NF-κB含量與WMCG比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;WMCG滑膜中NF-κB含量與ZSD-HG、ZSD-MG比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且ZSD-MG和ZSD-HG組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;CMCG和ZSD-MG滑膜中NF-κB含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2，圖1。

3?討論

痛風是因嘌呤代謝紊亂所導致的一組慢性代謝性疾病，MSU沉積是痛風的特征性病理改變[7]。關節(jié)軟骨、滑膜、關節(jié)周圍軟組織等部位變化主要是炎性反應細胞浸潤，MSU沉積而局部壞死、增生性變化。痛風早期MSU結晶從血液中析出進入關節(jié)腔中，滑液中的蛋白質(zhì)立即吸附結晶，并被巨噬細胞吞噬，多核白細胞、單核細胞浸潤，導致IL-1β、TNF-α等炎性反應因子大量分泌，誘發(fā)關節(jié)局部炎性反應發(fā)生[8-9]。

研究發(fā)現(xiàn)，痛風除了炎性反應機制外，氧化應激在痛風的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用[10]。促炎性反應因子可以引發(fā)人體內(nèi)氧化應激系統(tǒng)的激活，當氧化應激激活后，機體傾向于氧化，引起NO-、O2-、H2O2、RO-等物質(zhì)大量產(chǎn)生，在MSU晶體的和作用下，減弱細胞的生存能力，加快細胞凋亡的進程，進一步破壞關節(jié)組織[11-12]。與此同時，中性粒細胞在吞噬MSU晶體的過程中，可以誘導大量的酶體和蛋白酶的釋放，進一步加重氧化損傷[13]。GSH是一種小分子自由基清除劑，廣泛分布于機體內(nèi)，有谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成，是人體內(nèi)重要的抗氧化劑。GSH能夠使氧自由基失活，保護細胞抗氧化，防止其凋亡，減輕機體組織氧化應激的反應，減輕炎性反應，這是機體正常免疫調(diào)節(jié)過程。GSH-Px與GSH具有相似的作用，也是一種酶類抗氧化劑，可以清除氧自由基，抑制過氧化，從而保護機體組織免受損傷[14]。

本實驗結果顯示，造模后，MG與BG比較，血清中GSH、GSH-Px水平顯著下降（P<0.01），說明在痛風大鼠中GSH、GSH-Px呈低表達，大鼠體內(nèi)發(fā)生炎性反應時，產(chǎn)生的炎性反應因子損傷氧化防御系統(tǒng)。ZSD-HG和ZSD-MG與MG比較，GSH、GSH-Px濃度明顯上調(diào)（P<0.05），證實資生腎氣丸中藥復方能夠調(diào)節(jié)機體抗氧化作用，降低O2-含量，間接抑制活性氧激活炎性反應的途徑，從而起到防治痛風的作用。CMCG和ZSD-LG血清中GSH、GSH-Px含量上調(diào)（P<0.05），而與秋水仙堿對照組比較差異仍有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明秋水仙堿和ZSD-MG、ZSD-HG對痛風的療效較佳。

1986年美國麻省理工學院癌癥研究中心的Baltimore和生物醫(yī)學研究所的Rwiansen首次發(fā)現(xiàn)NF-κB，他們在成熟的漿細胞和B細胞中發(fā)現(xiàn)一種蛋白與免疫球蛋白κ-輕鏈基因增強子的B位點結合，調(diào)控免疫球蛋白κ-輕鏈上基因的轉錄，因此命名其為核轉錄因子κB（NF-κB）[15]。經(jīng)典的NF-κB信號通路是當細胞受到病原微生物、細胞因子等刺激時，引起特異性跨膜受體（如Toll樣受體、白細胞介素-1受體等）的空間構象發(fā)生變化，經(jīng)過一系列復雜的級聯(lián)反應使IκB激酶復合物（IKK）激活。正常狀態(tài)下，NF-κB在胞質(zhì)內(nèi)與NF-κB抑制蛋白結合呈現(xiàn)為非活性狀態(tài)。但激活的IKK可以使NF-κB從非活性狀態(tài)的復合體結構中釋放出來，并轉入核內(nèi)與靶基因啟動子結合，調(diào)節(jié)靶基因的表達，NF-κB調(diào)節(jié)的靶基因編碼蛋白包括多種細胞因子、趨化因子等。激活的NF-κB又可使IL-1β等促炎性反應因子釋放，進一步激活炎性反應，而釋放出來的IL-1β可以通過一系列的炎癥級聯(lián)反應激活NF-κB，因此形成了惡性循環(huán)，擴大炎性反應，促進痛風炎性反應發(fā)生[16-17]。

本實驗采用Western blot法檢測各組大鼠滑膜中NF-κB表達，結果顯示MG與BG比較，滑膜組織NF-κB表達增強（P<0.01），說明在痛風大鼠中尿酸鹽刺激引發(fā)NF-κB激活，促進了炎性反應發(fā)生。ZSD-MG、ZSD-HG與MG比較，NF-κB含量明顯下降（P<0.01），證實了資生腎氣丸中藥復方能夠降低NF-κB含量，直接抑制炎性反應因子的釋放，這可能是資生腎氣丸中藥復方防治GA的作用機制之一。

痛風作為病名首載于丹溪的《格致余論》，在此之前，該病皆以痹證統(tǒng)稱。醫(yī)圣張仲景首創(chuàng)“歷節(jié)病”之名，他在《金匱要略》中描述“疼痛如掣”“身體贏瘦”“獨足腫大”“諸肢節(jié)疼痛”等作為歷節(jié)病的主要表現(xiàn)癥狀，條文中的關節(jié)疼痛、腫脹、畸形等與痛風尤為相似。孫思邈認為痹病為“腎虛”復感“外邪”而致，定當補虛、祛邪并用，而這一思想，一直貫穿宋、元、明、清乃至如今的各代醫(yī)學實踐中，對后世影響深遠。痛風性關節(jié)炎臨證雖紛雜繁多，而中醫(yī)在攻克難治疾病中發(fā)揮著得天獨厚的優(yōu)勢。本課題組精研經(jīng)典并結合多年的臨床經(jīng)驗，提出補腎利濕為法為痛風治療大法。本課題組認為，現(xiàn)代人群，多久勞傷腎，飲食不節(jié)，致脾腎受損，代謝失衡，產(chǎn)生痰飲、瘀血等，痰瘀互結，痹阻經(jīng)絡，流注關節(jié)，則出現(xiàn)肢體腫脹疼痛，甚至僵硬、變形。故腎虛作為疾病發(fā)生的前提條件，貫穿于疾病的始終，痰濁為疾病發(fā)生發(fā)展的病理產(chǎn)物，二者互為因果，互相影響，最終導致痛風發(fā)生。痛風之疾，當以補腎為本，兼除濕邪而愈。本課題組采用補腎利濕法指導臨床用藥，選用資生腎氣丸化裁治療痛風，方藥組成由熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、懷牛膝、土茯苓、萆薢等中藥組成。本方重用熟地黃取其滋腎陰，益精髓之效，山茱萸平補肝腎，有“肝腎同源”之意。山藥補脾益腎，與熟地黃、山茱萸相合，補腎以治其本。澤瀉為臣，既利濕而泄腎濁之氣，又可防熟地黃滋膩太過之功。土茯苓，集解毒、除濕、通利關節(jié)于一體，且氣味平和。萆薢利濕祛濁，祛風除痹。最終以懷牛膝、牡丹皮為佐藥，取其活血通絡除痹之效，牛膝引諸藥下行，作用于關節(jié)而發(fā)揮其療效。諸藥合用，標本兼治，共奏補腎利濕之功。

綜上所述，本研究顯示資生腎氣丸復方中藥可以明顯提高痛風模型大鼠血清中GSH-Px與GSH的含量，降低滑膜中NF-κB的活性，所以推測資生腎氣丸可通過提高機體抗氧化能力，抑制炎性反應轉錄因子激活，從而緩解痛風的炎性反應癥狀，為資生腎氣丸治療痛風提供實驗依據(jù)。

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（2018-12-12收稿?責任編輯：芮莉莉）