沈洋 趙歡 潘一鳴 呂鵬 曾志豪 李亞 侯麗

摘要?目的：探討烏梅丸為對免疫性結(jié)腸炎大鼠核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及抑炎性因子IL-10表達(dá)的影響。方法：實(shí)驗(yàn)動物40只隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性對照組、烏梅丸低劑量組、烏梅丸高劑量組，半抗原2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）加乙醇局部灌腸復(fù)制免疫性結(jié)腸炎模型，每天進(jìn)行疾病活動指數(shù)（TDI）評分，ELISA測定大鼠血清IL-10水平，Western Blot法測定病變結(jié)腸組織NF-κB表達(dá)水平。結(jié)果：模型大鼠造模給藥后出現(xiàn)便血、稀便、精神萎靡、解剖觀察結(jié)腸黏膜組織有潰瘍形成;與正常對照組比較，模型組大鼠血清IL10水平降低、結(jié)腸黏膜組織NF-kB表達(dá)升高（P<0.05）;給藥處理后，各組NF-kBp65表達(dá)較模型組均降低，其中烏梅丸低劑量組降低最為顯著;陽性對照組血清IL-10表達(dá)升高，烏梅丸低劑量組、烏梅丸高劑量組降低（P<0.05）。結(jié)論：烏梅丸對免疫性結(jié)腸炎大鼠炎性活化過程中NF-kBp65激活有顯著抑制作用，從而抑制其下游炎性因子表達(dá)，降低損傷，血清中IL-10的低表達(dá)可能與烏梅丸募集IL-10向結(jié)腸病變組織減少損傷相關(guān)。

關(guān)鍵詞?烏梅丸;甲潑尼龍片;免疫治療;不良反應(yīng);免疫性結(jié)腸炎;IL-10;NF-κB;TDI評分

Effect of Wumei Pills on NF-κB and IL-10 in Mice with Immunotherapy-Induced Colitis

Shen Yang，Zhao Huan，Pan Yiming，Lyu Peng，Zeng Zhihao，Li Ya，Hou Li

（Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China）

Abstract?Objective：To investigate the effect of Wumei Pills on the expression of NF-κB and IL-10 in rats with immune colitis.Methods：A total of 40 experimental animals were randomly divided into a normal control group，a model group，a positive control group，a Wumei Pills low-dose group，high-dose group.Colitis was induced in mice by intracolonic instillation of 2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid（TNBS）.Disease activity index（DAI）score was recorded daily for colitis assessment.Serum IL-10 level was measured by ELISA and NF-κB expression was determined by Western blotting.Results：A model was considered a success when bloody and loose stool，sluggishness，and ulcerative lesions of the colonic mucosa were observed upon intracolonic instillation of TNBS.Compared with the normal control group，there was a decrease in serum IL-10 level and an increase in NF-κB expression in the model group（P<0.05）.Upon herbal intervention，NF-κB p65 expression in each group was lower than that in the model group，with the Wumei Pills low-dose group showing the most significant difference.Serum IL-10 level increased in the positive control group and decreased in both the Wumei Pills low-dose and high-dose groups（P<0.05）.Conclusion：Wumei Pills significantly inhibits the activation of NF-κBp65 during inflammatory activation in rats with immune colitis，thereby inhibiting the expression of downstream inflammatory factors and reducing damage.The reduction of tissue damage by Wumei Pills might be associated with low serum IL-10 level.

Key Words?Wumei Pills; Methylprednisolone; Immunotherapy; Side effects; Immune colitis; IL-10; NF-κB; TDI

中圖分類號：R289文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.019

以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表腫瘤免疫治療是繼靶向治療后又一種新興的治療手段。免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過解除腫瘤局部微環(huán)境免疫抑制，進(jìn)而促使效應(yīng)T細(xì)胞恢復(fù)特異性識別功能進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。正常組織免疫抑制受到破壞可導(dǎo)致自身免疫耐受受到損害，進(jìn)而導(dǎo)致免疫治療相關(guān)不良反應(yīng)（Immune-related Adverse Events，irAEs），常見受累部位包括皮膚、消化道、肝臟、甲狀腺等，結(jié)腸炎是最常見的消化道不良反應(yīng)之一，免疫治療導(dǎo)致的免疫功能紊亂是免疫治療相關(guān)性結(jié)腸炎的病因所在，發(fā)病與潰瘍性結(jié)腸炎類似。本研究參考免疫性結(jié)腸炎模型，觀察烏梅丸對結(jié)腸炎大鼠血清IL-10、病變結(jié)腸黏膜NF-κB影響，探討烏梅丸是否可以從調(diào)節(jié)免疫角度改善免疫性結(jié)腸炎性反應(yīng)狀，為今后腫瘤免疫治療不良反應(yīng)的臨床策略提供思路。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?Sprague Dawley大鼠40只，雄性，體質(zhì)量（25010）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，SPF級。動物許可證號：SCXK-（京）2013-0035。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度（24±2）℃，相對濕度（50±10）%，自由攝食飲水，12 h/12 h明暗交替。

1.1.2?藥物?卓美樂（甲潑尼龍片，Pfizer Italia SrI公司產(chǎn)品，T96680），購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，烏梅丸顆粒劑（烏梅24 g、細(xì)辛9 g、干姜15 g、黃連24 g、當(dāng)歸6 g、黑附子9 g、蜀椒6 g、桂枝9 g、黨參9 g、黃柏9 g）由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3?試劑與儀器?2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，美國sigma公司，批號：P2297）;白細(xì)胞介素-10（IL-10）ElISA試劑盒（abcam，批號：ab100764）;NF-κB p65山羊抗小鼠一抗（MDL公司，批號：MD2142），β-actin山羊抗兔一抗（MDL公司，批號：MD2141），酶標(biāo)儀（BIO-RAD，型號：550），電熱恒溫水浴槽（上海一恒恒溫設(shè)備廠，型號：HWS-24）;-80 ℃低溫冰箱[日本SANYO，型號：MDF-C8V（N）]4 ℃低溫冰箱（青島海爾冰箱股份有限公司，型號：HXC-106）;制冰機(jī)（美國SCOTSMAN，型號：AF10）;PVDF膜（0.22 μm）（美國Millipore，型號：ISEQ00010）;3MM濾紙（英國Whatman，型號：3030861）;脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司，型號：TS-100）;旋渦混勻器（海門麒麟醫(yī)用儀器廠，型號：XW-80A）;電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司，型號：BG-subMIDI）;低溫離心機(jī)（Sigma，型號：3-30K）;SDS-PAGE電泳系統(tǒng)（美國BIO-Rad，型號：1645056）;凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP，型號：GelDoc-It310）;ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-rad，型號：170-8280）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?分組：造模32只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組、烏梅丸低劑量組、烏梅丸高劑量組，每組8只。模型制備：超凈工作臺下先配制50%乙醇溶液，然后和50 g/L的TNBS等體積混合制成免疫復(fù)合物，造模前現(xiàn)用現(xiàn)配。大鼠禁食（不禁水）24 h，10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 mL/100 g）后仰臥位固定于木板，食用油涂抹肛周，32只大鼠按照TNBS 100 mg/kg劑量用2 mm硅膠管（食用油潤滑）連接注射器由肛門插入8 cm局部灌腸1次，再注入0.5 mL空氣，注射完畢動物頭部向下木板微微傾斜約30° 2 min，從木板取下大鼠歸籠，自然蘇醒，恢復(fù)飲食。其余8只大鼠同樣方法給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2?給藥方法?模型組按1 mL/100 g灌胃生理鹽水，陽性對照組按2 mg/kg卓美樂水溶液，烏梅丸低劑量組按照生藥量13.4 g/kg灌胃烏梅丸藥液，烏梅丸高劑量組按照生藥量26.8 g/kg灌胃烏梅丸藥液，于造模3 d后開始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法?給藥期間每天記錄體質(zhì)量，觀察大鼠體征、大便性狀、隱血情況，并進(jìn)行疾病活動指數(shù)（Disease Activity Index，DAI）評分，見表1，評估疾病活動狀態(tài)。給藥14 d后禁食24 h，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，股動脈取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，剖腹取病變部位結(jié)腸組織。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)后，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)數(shù)據(jù)組間比較以單因素方差分析，非正態(tài)數(shù)據(jù)組間比較用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?一般狀態(tài)比較?除正常對照組外，各組大鼠造模后當(dāng)天出現(xiàn)便血、稀便，便血由肉眼血便變?yōu)闈撗渤掷m(xù)3～5 d，食量減少，體質(zhì)量下降，肛周污濁，毛色暗淡粗糙沾染糞便，隨時(shí)間推移，各組大鼠體質(zhì)量先下降后持續(xù)增長，烏梅丸低劑量組癥狀好轉(zhuǎn)最明顯，飲食逐漸恢復(fù)、毛色潤澤、行動積極活躍，大便性狀由稀轉(zhuǎn)干、逐漸成形;其次是陽性對照組，飲食一般，具有一定體力，大便始終未成形;高劑量組癥狀改善有限，形體消瘦，大便次數(shù)多、稀便，蜷臥懶動。取材時(shí)模型組大鼠結(jié)腸壁厚薄不均，腸壁縱向切開觀察可見腸黏膜潰瘍、糜爛，黏膜表面水腫，給藥各組大鼠結(jié)腸黏膜表現(xiàn)為不同程度充血水腫，潰瘍較模型組少見，烏梅丸高劑量組腸道內(nèi)可見藥物殘?jiān)?/p>

2.2?TDI評分?給藥后各組TDI評分隨時(shí)間均逐漸降低，前期由于便血、體質(zhì)量降低等因素DAI評分普遍偏高，各組間DAI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;便血停止后體質(zhì)量逐漸復(fù)，影響DAI的主要因素為大便性狀，烏梅丸低劑量組大便性狀改善最為明顯，給藥終點(diǎn)大便性狀幾乎恢復(fù)正常，從第5天開始與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，陽性藥組和烏梅丸高劑量組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與陽性藥組比較，烏梅丸低劑量組從第6天開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），烏梅丸高劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。烏梅丸低劑量組與烏梅丸高劑量組比較，從第5天開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2?IL-10表達(dá)情況?與對照組比較，模型組大鼠血清IL-10表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組血清IL-10表達(dá)升高，烏梅丸低劑量組、烏梅丸高劑量組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與陽性對照組比較，烏梅丸低劑量組、烏梅丸高劑量組血清IL-10表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3?各組大鼠腸黏膜NF-κB表達(dá)情況?與對照組比較，模型組大鼠NF-κB表達(dá)升高（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組、烏梅丸低劑量組、烏梅丸高劑量組NF-κB表達(dá)降低（P<0.05）;與陽性對照組比較烏梅丸低劑量組、烏梅丸高劑量組NF-κB表達(dá)降低（P<0.05）。見表4，圖1。

3?討論

腹瀉是接受腫瘤免疫治療患者最常見胃腸道不良反應(yīng)，而該癥狀的發(fā)生與結(jié)腸炎密切相關(guān)（腹部疼痛、放射檢查、內(nèi)窺鏡檢查）[1]。CTLA-4和PD-1/PD-L1兩類免疫檢查點(diǎn)抑制劑比較，接受前者治療發(fā)生腹瀉的機(jī)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于后者。接受了ipilimumab（CTLA-4）治療的患者任何等級腹瀉發(fā)生率約30%，嚴(yán)重（3級以上）腹瀉的發(fā)生率大約為10%[2]，結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)間集中在3次治療之后，持續(xù)34 d左右，與給藥量無明顯相關(guān)性[3]。約5%的患者發(fā)生了嚴(yán)重（3級以上）結(jié)腸炎[4]，而遲發(fā)型結(jié)腸炎發(fā)生率更高，有研究顯示接受CTLA-4免疫治療的腫瘤患者發(fā)生遲發(fā)性結(jié)腸炎的機(jī)率高達(dá)12%，伴發(fā)的出血、腸穿孔和難治性腹瀉等棘手癥狀甚至需要手術(shù)來解決[5]。相對CTLA-4免疫檢查點(diǎn)抑制劑而言，PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑胃腸道相關(guān)irAEs輕緩許多[6]，黑色素瘤患者接受nivolumab單抗治療后，17%患者被觀察到腹瀉、結(jié)腸炎，只有1.2%患者發(fā)生3級以上嚴(yán)重胃腸道相關(guān)irAEs，接受另外一個PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑pembrolizumab的患者，結(jié)腸炎發(fā)生率為2.8%，與用藥量呈正相關(guān)，2種PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑比較，pembrolizumab胃腸道相關(guān)irAEs平均持續(xù)時(shí)間（大約18周）遠(yuǎn)大于nivolumab（大約6周）[7]。腫瘤治療相關(guān)免疫性結(jié)腸炎臨床處理以靜脈輸注糖皮質(zhì)激素為主，同時(shí)停止免疫治療，糖皮質(zhì)激素治療無效者需考慮加用英夫利昔（Infliximab）等免疫抑制劑[8-10]，停藥再加糖皮質(zhì)激素的免疫抑制作用，會大大降低免疫治療的有效性，免疫抑制劑的加入，還可能增加機(jī)會性感染的風(fēng)險(xiǎn)。隨著腫瘤免疫治療臨床推進(jìn)，將來我國會出現(xiàn)大量接受免疫治療患者，免疫治療相關(guān)性結(jié)腸炎患者的數(shù)量屆時(shí)也會激增，因此提早研究解決辦法具有前瞻性、可行性、必要性。

白細(xì)胞介素-10（IL-10）是一種具有抗炎及免疫抑制作用的細(xì)胞因子，由CD4+的T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞等分泌，具有抑制巨噬細(xì)胞活性，抑制IL-1、IL-6、TNF-α等炎性反應(yīng)細(xì)胞因子分泌的功能，在免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中具有不可替代的作用[11-13]。IL-10主要通過JAK-STAT途徑發(fā)揮作用，當(dāng)IL-10與IL-10受體1結(jié)合后發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，暴露IL-10受體2的結(jié)合位點(diǎn)，在2個受體彼此靠近后引起細(xì)胞中JAK1和TyK2的激活，引起JAK1的磷酸化，進(jìn)而激活STAT3從而選擇性地抑制或激活轉(zhuǎn)錄基因發(fā)揮作用[14]。研究顯示IL-10在克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中都有著十分重要的作用[15-17]。正常腸道內(nèi)定植有細(xì)菌菌群，不斷地和食物抗原和潛在的病原體接觸，卻不至于發(fā)生慢性腸道炎性反應(yīng)，保持了腸道免疫上的穩(wěn)態(tài)，這是多種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制相互作用的結(jié)果，而在諸多機(jī)制之中，IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β的作用尤為關(guān)鍵[18]。核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，在收到炎性反應(yīng)遞質(zhì)刺激后激活，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在炎性反應(yīng)、免疫、細(xì)胞的增殖以及凋亡等中發(fā)揮重要作用[19-20]。NF-κB未被激活時(shí)，與核因子κB抑制蛋白相結(jié)合并以無活性的三聚體形式存在，在細(xì)胞收到刺激后，核因子κB抑制蛋白磷酸化后降解，而NF-κB則和蛋白結(jié)合移位至細(xì)胞核，和靶序列相結(jié)合，激活下游轉(zhuǎn)錄基因[21]。NF-κB對炎性反應(yīng)遞質(zhì)的刺激敏感，是炎性反應(yīng)的敏感核轉(zhuǎn)錄因子，通過促進(jìn)炎性細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄使得IL-1、IL-6、TNF-α等炎性反應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)增加導(dǎo)致炎性反應(yīng)的強(qiáng)化[22]。在炎性反應(yīng)性腸病的腸道上皮細(xì)胞中NF-κB明顯激活，而在正常的腸道的上皮中則無激活[23]。對潰瘍性結(jié)腸炎的小鼠使用NF-κB反義寡核苷酸灌腸，可以降低其IL-1、IL-6、TNF-α的水平，改善其癥狀和組織損傷[24]。

本研究顯示烏梅丸可降低免疫性結(jié)腸炎大鼠病變結(jié)腸組織NF-κB水平，進(jìn)而抑制IL-1等炎性因子分泌，從而達(dá)到減輕炎性損傷的目的;既往研究顯示，烏梅丸可顯著抑制結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織IL-1表達(dá)，促進(jìn)IL-10表達(dá)，維持細(xì)胞因子中促炎因子和抗炎因子間的平衡，從而對潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用[25]。本次研究發(fā)現(xiàn)烏梅丸干預(yù)后，結(jié)腸炎大鼠血清中IL-10表達(dá)降低，血清IL-1表達(dá)升高，出現(xiàn)與結(jié)腸組織中相反的趨勢，提示烏梅丸對結(jié)腸炎大鼠的治療作用遠(yuǎn)不止調(diào)節(jié)局部細(xì)胞因子中促炎因子和抗炎因子間的產(chǎn)生平衡，還可能具有抑制IL-1等相關(guān)炎性因子遷移至病變部位、募集IL-10等抑炎因子至病變結(jié)腸部位的作用，進(jìn)一步減輕炎性損傷作用。隨著我國腫瘤免疫治療臨床工作的大量開展，免疫治療胃腸道不良反應(yīng)患者數(shù)量將會激增，本研究具有一定的前瞻性并為治療腫瘤免疫治療不良反應(yīng)提供一定的治療思路，但本次研究借用動物模型為免疫性結(jié)腸炎模型，并非腫瘤免疫治療藥物誘發(fā)，具有一定局限性。

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（2018-12-26收稿?責(zé)任編輯：王明）