甘露菁 榮菡 楊丹 王磊

摘?要：以斑馬魚為實驗對象，應(yīng)用雙箱動力學(xué)模型模擬了其暴露在不同濃度的3種重金屬（Cu、Pb、Ni）養(yǎng)殖水中，考察其在富集與排出過程中的生物富集規(guī)律，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）對斑馬魚體內(nèi)重金屬含量進行動態(tài)監(jiān)測，并對結(jié)果進行非線性擬合，得到斑馬魚富集重金屬的動力學(xué)參數(shù)。對模型擬合度檢驗表明雙箱動力學(xué)模型擬合程度良好，可用于描述Cu、Pb和Ni在斑馬魚體內(nèi)的生物富集規(guī)律。結(jié)果表明：斑馬魚對水中重金屬的富集能力與暴露濃度呈正相關(guān)，而其對不同重金屬的富集具有選擇性，對3種重金屬生物富集能力由強到弱排序為Cu>Pb>Ni，其中斑馬魚對Cu的富集能力極強。此外，斑馬魚對3種重金屬的排出速率系數(shù)與生物半衰期均與暴露濃度無明顯相關(guān)性，不同種類的重金屬在斑馬魚體內(nèi)的生物半衰期按時間長短排序為Ni>Pb>Cu，但排出階段結(jié)束后，斑馬魚體內(nèi)的重金屬濃度依然高于初始濃度數(shù)倍甚至數(shù)十倍。

關(guān)鍵詞：斑馬魚;生物富集動力學(xué);銅;鉛;鎳

近年來，我國水體重金屬污染問題十分突出，大量的重金屬元素排放至地表徑流進入水生生態(tài)環(huán)境[1]，影響水生生物食品安全性[2-4]，人類食用重金屬超標(biāo)的水生生物后會造成不同程度的急性或慢性中毒現(xiàn)象[5]。斑馬魚因具有時代周期短、產(chǎn)卵多且受精卵容易觀察等優(yōu)點，被很多學(xué)者當(dāng)做受試生物用在重金屬對水生生物的毒性作用研究中。如李淑瓊等[6]采用斑馬魚為試驗生物，進行了靜態(tài)方式的急性毒性試驗，獲得了Zn、Cr、Cd的12 h半致死濃度。李汝等[7]將斑馬魚的運動行為學(xué)與水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測相結(jié)合，實現(xiàn)了生物魚運動學(xué)指標(biāo)監(jiān)測水質(zhì)變化的目標(biāo)。但目前將斑馬魚用在對重金屬污染的生物作用過程研究較為少見，尤其是缺乏富集動力學(xué)方面的研究，使得人們對重金屬在魚類體內(nèi)富集的動力學(xué)特征缺乏系統(tǒng)的認識。雙箱動力學(xué)作為一種數(shù)學(xué)模型，普遍用于重金屬的生物富集研究，如貽貝[ 8-9]、牡蠣[10]、滸苔[11]等。本研究以斑馬魚作為研究對象，運用雙箱動力學(xué)模型研究銅（Cu）、鉛（Pb）和鎳（Ni）3種重金屬在不同濃度下在其體內(nèi)的生物富集動力學(xué)特性，以提高對其動力學(xué)特性的系統(tǒng)認識，對斑馬魚用于重金屬預(yù)測提供科學(xué)依據(jù)，也可為魚類富集重金屬的食用安全研究提供支撐。

1?材料與方法

1.1?動物、材料與試劑

斑馬魚，購于珠海市拱北花鳥魚市場，體質(zhì)量0.35±0.08g。實驗前對斑馬魚進行馴養(yǎng)[12]，時間為7d，期間維持自然光照周期，養(yǎng)殖水溫27±1℃，pH值7.0±0.5，溶解氧不低于5.0mg/L，自來水充分曝氣24h作為培養(yǎng)用水，飼喂魚專用全價顆粒料，購自青島海洋大學(xué)飼料廠。實驗期間亦保持此飼養(yǎng)條件。Cu、Pb、Ni標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000mg/L），購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，ICP-MS調(diào)諧液，由Perkin Elmer原裝進口，濃硝酸為優(yōu)級純，天津大茂，水為超純水，所用容量瓶使用前均經(jīng)20%硝酸浸泡3d。

1.2?儀器與設(shè)備

ELAN DRC-e電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Perkin Elmer公司;Mars5微波消解儀，美國CEM公司;Mili-Q超純水儀，美國Millipore公司。

1.3?方法

1.3.1?樣品采集?參考GB 11607—1989《國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》對Cu、Pb和Ni含量的規(guī)定設(shè)計暴露濃度。實驗按照Cu、Pb和Ni暴露濃度分為4組，即空白對照組（Cu、Pb和Ni的濃度為0）、低劑量組（Cu、Pb和Ni的濃度均為10μg/L）、中劑量組（Cu、Pb和Ni的濃度均為50μg/L）、高劑量組（Cu、Pb和Ni的濃度均為100μg/L）。斑馬魚置于100L聚乙烯水箱中，每組水箱中加入60L含有不同濃度Cu、Pb和Ni的復(fù)合溶液。每個水箱中放入斑馬魚300只，進行重金屬的富集。實驗采用半靜態(tài)的方法，每天換 1 次同種濃度的實驗用水，以保持水體中重金屬濃度恒定。富集實驗時間為20d，取樣間隔為4h、12h、1d、2d、4d、6d、8d、12d、20d，每次隨機取10條斑馬魚進行分析，采集的魚樣用蒸餾水沖洗后，整魚勻漿后冷凍，備分析。富集實驗結(jié)束后即進行排出實驗，將剩下的斑馬魚置于另一批100L水箱中，4組均不再向水中加入重金屬，排出階段為20d，取樣間隔為1、2、4、6、8、12、20d，采樣方法同上。

1.3.2?樣品制備與分析?準(zhǔn)確稱取勻漿后的斑馬魚樣品0.5g置于微波消解罐中，加硝酸6mL后，置于已設(shè)定好程序的微波工作站中進行消解，升溫程序為3 min 升溫至 120 ℃保持 3 min，2 min升溫至 150 ℃保持 3 min，2 min 升溫至 200 ℃保持 12 min[13]。

ICP-MS操作參數(shù)：等離子體氣流量：15L/min;射頻功率：1 100W，霧化室溫度：2 ℃;霧化器流量：0.89L/min;輔助氣流量：1.2L/min，蠕動泵轉(zhuǎn)速：24r/min;離子透鏡電壓：10V;數(shù)據(jù)采樣模式：跳峰采集模式;采樣深度：10 mm;重復(fù)次數(shù)：3 次;掃描次數(shù)：100 次。

1.3.3?實驗應(yīng)用模型?目前重金屬在生物體和水體之間的作用過程多用兩相分配模型中的雙箱動力學(xué)模型進行描述[14]。重金屬在生物體內(nèi)的富集通?？煽醋魇侵亟饘僭谏矬w與水相之間的兩相間的分配過程，則富集及釋放過程可用一級動力學(xué)過程對其進行描述（圖1）。

其中，含有重金屬污染物的水體作為第一相，生物體作為第二相，那么水體相中重金屬濃度的變化為：

而生物體相中重金屬的濃度變化為：

式（2）中，C-W為水體相中重金屬污染物的濃度（μg/L）;C-A為生物體相中重金屬污染物的濃度（μg/kg）;t為實驗進行的時間（d）;K-1為生物吸收速率常數(shù);K-2為生物排出速率常數(shù);K-M為生物代謝速率常數(shù);K-V為重金屬污染物揮發(fā)速率常數(shù)。由于本實驗中重金屬在體內(nèi)難以揮發(fā)，且短時間內(nèi)在斑馬魚體內(nèi)的代謝影響基本可以忽略，故可將K-M和K-V視為零。因此，由式（1）～（2）推導(dǎo)可得斑馬魚對重金屬的富集和排出方程[15]：

式（4）中，t*為富集階段的實驗天數(shù)（d），本研究中為20d;C-0為實驗開始前生物體內(nèi)原本含有的重金屬污染物濃度（μg/kg）。

根據(jù)式（3）～（4），對監(jiān)測所得重金屬濃度數(shù)據(jù)進行非線性擬合得到K-1 和K-2值。那么在理論平衡狀態(tài)下，可求得生物富集系數(shù)（bioconcentration factors，BCF）：

重金屬的生物學(xué)半衰期，即生物體排出一半體內(nèi)的重金屬所需要的時間：

亦可通過模型計算出生物富集達到理論平衡時，體內(nèi)重金屬的最大含量C-Amax：

1.4?數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用Excel 2010及Origin 8.0進行模型擬合與分析。通過卡方檢驗結(jié)合判定系數(shù)R2來評價該模型的擬合度，驗證雙箱模型用于斑馬魚對重金屬Cu、Pb、Ni的生物富集研究可行性。

2?結(jié)果與分析

2.1?3種重金屬在斑馬魚體內(nèi)的富集與排出規(guī)律

由圖2可知，富集階段Cu在斑馬魚體內(nèi)的富集量與對照組相比都有明顯升高，且都與富集時間、暴露質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。富集時間結(jié)束時（20d），斑馬魚對3種不同質(zhì)量濃度的Cu富集均未達到平衡，但富集量已分別達到初始濃度的8.9（10μg/L暴露質(zhì)量濃度）、18.5（50μg/L暴露質(zhì)量濃度）、28.2倍（100μg/L暴露質(zhì)量濃度）。

在排出階段，Cu在斑馬魚體內(nèi)的富集量明顯隨著排出時間的延長逐漸降低，并在排出階段的第8天后趨于平緩。但實驗結(jié)束時，體內(nèi)的Cu濃度依然是初始濃度的4～16倍。

由圖3可知，與Cu相似，富集階段Pb在斑馬魚體內(nèi)的富集量與對照組相比都有明顯升高，且都與富集時間、暴露質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。富集時間結(jié)束時（20d），斑馬魚對3種不同質(zhì)量濃度的Pb富集均未達到平衡，但富集量已分別達到初始濃度的16.1（10μg/L暴露質(zhì)量濃度）、21.7（50μg/L暴露質(zhì)量濃度）、29.0倍（100μg/L暴露質(zhì)量濃度）。在排出階段，Pb在斑馬魚體內(nèi)的富集量隨著排出時間的延長明顯減少，并在排出階段的第8天后減少幅度趨于平緩。40d實驗結(jié)束時，體內(nèi)的Pb濃度依然是初始濃度的9.8～19.3倍。

由圖4可知，與前兩種重金屬相似，富集階段Ni在斑馬魚體內(nèi)的富集量與對照組相比都有明顯升高，且都與富集時間、暴露質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。富集時間結(jié)束時（20d），斑馬魚對3種不同質(zhì)量濃度的Ni富集均未達到平衡，但富集量已分別達到初始濃度的6.0（10μg/L暴露質(zhì)量濃度）、10.3（50μg/L暴露質(zhì)量濃度）、14.6倍（100μg/L暴露質(zhì)量濃度）。在排出階段，Ni在斑馬魚體內(nèi)的富集量明顯隨著排出時間的延長逐漸降低，但實驗結(jié)束時，體內(nèi)的Ni濃度依然是初始濃度的2.7～7.7倍。

2.2?3種金屬在斑馬魚體內(nèi)的生物富集動力學(xué)參數(shù)

對圖2～4的數(shù)據(jù)進行非線性擬合，得到吸收速率常數(shù)K-1、排出速率常數(shù)K-2，再根據(jù)式（5）～（7）得到斑馬魚對3種重金屬生物富集的其他動力學(xué)參數(shù)BCF、體內(nèi)理論平衡最大濃度（C-Amax）和生物半衰期（附表）。

由附表可見，斑馬魚對3種重金屬Cu、Pb和Ni的K-1、BCF、C-Amax基本隨著重金屬暴露濃度增大而增大，而K-2則與暴露濃度無明顯相關(guān)性。BCF描述的是生物對污染物的富集能力，對比可知，斑馬魚對3種不同重金屬的富集能力排序為Cu>Pb>Ni，其中對Cu的富集能力極強，此富集能力排序與Lim等[16]的研究相似。生物半衰期描述的是生物排出體內(nèi)污染物的能力，由附表可見，暴露濃度對排出時間基本沒有影響，但是不同種類的重金屬在斑馬魚體內(nèi)不同，其排序為Ni>Pb>Cu，其中Ni的平均為32.5d、Pb的為15.9d、Cu的為12.9d。由此可見，斑馬魚對Cu的富集能力較強，但排出速度也較快，而其對Ni的富集能力較弱，但排出亦慢。

從附表可以看出，3種重金屬不同濃度下的回歸方程都達到極顯著水平（P<0.001），相關(guān)系數(shù)R2都在0.9以上，可見此模型擬合程度良好，可用于描述Cu、Pb、Ni在斑馬魚體內(nèi)的富集與排出規(guī)律。

3?結(jié)論

本研究通過模擬斑馬魚養(yǎng)殖環(huán)境，使其分別暴露在重金屬Cu、Pb和Ni濃度分別為10、50、100μg/L的養(yǎng)殖水中，通過在不同時間測定斑馬魚體內(nèi)重金屬的濃度變化，研究斑馬魚對3種重金屬的富集規(guī)律。研究分為富集階段與排出階段，在富集階段中，斑馬魚對水中重金屬的富集能力隨著暴露濃度增加而增加，而其對不同重金屬的富集具有選擇性，3種重金屬中，斑馬魚對Cu的富集能力極強，其C-Amax最高可達1.8×106μg/kg，BCF最高可達1.8×104。斑馬魚對3種重金屬生物富集能力由強到弱排序為Cu>Pb>Ni。在排出階段中，斑馬魚對3種重金屬的排出速率系數(shù)與生物半衰期均與暴露濃度無明顯相關(guān)性，不同種類的重金屬在斑馬魚體內(nèi)的B1/2按時間長短排序為Ni>Pb>Cu，但排出階段結(jié)束后，斑馬魚體內(nèi)的重金屬濃度依然高于初始濃度數(shù)倍甚至數(shù)十倍，說明受到重金屬污染的斑馬魚，即使在無重金屬污染的水中進行飼養(yǎng)，依然難以達到釋放重金屬的目的。本研究有助于了解Cu、Pb和Ni 3種重金屬在斑馬魚體內(nèi)的生物富集動力學(xué)特性，對斑馬魚用于重金屬預(yù)測，尤其是Cu，提供科學(xué)依據(jù)與研究支撐。

參考文獻

[1]劉宗平.環(huán)境鉛鎘污染對動物健康影響的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（1）：185-186.

[2]張海清，余海珊，崔杰鋒，等.龍灣涌沉積物重金屬污染現(xiàn)狀評價[J].中國環(huán)境管理，2001（2）：29-31.

[3]簡敏菲，游海，倪才英.鄱陽湖饒河段重金屬污染水平與遷移特性[J].湖泊科學(xué)，2006，18（2）：127-133.

[4]王勝強，孫津生，丁輝.海河沉積物重金屬污染及潛在生態(tài)風(fēng)險評價[J].環(huán)境工程，2005，23（2）：62-64.

[5]帥俊松，王琳.淺論重金屬污染對人體健康的影響及對策[J].環(huán)境與開發(fā)，2001，16（4）：62.

[6]李淑瓊，周勤.重金屬對預(yù)警生物斑馬魚的急性毒性研究[J].科技通報，2010，26（3）：454-457.

[7]李汝.基于斑馬魚行為學(xué)的水質(zhì)監(jiān)測預(yù)警技術(shù)試驗研究[D].濟南：山東建筑大學(xué)，2015.

[8]張少娜，孫耀，宋云利，等.紫貽貝（Mytilus edulis）對4種重金屬的生物富集動力學(xué)特性研究[J].海洋與湖沼，2004，35（5）：438-445.

[9]張少娜.經(jīng)濟貝類對重金屬的生物富集動力學(xué)特性的研究[D].山東青島：中國海洋大學(xué)，2003.

[10]王曉麗，孫耀，張少娜，等.牡蠣對重金屬生物富集動力學(xué)特性研究[J].生態(tài)學(xué)報，2004，24（5）：1086-1090.

[11]劉智禹，吳靖娜，李琳，等.滸苔對鎘、鉛和鋁的生物富集動力學(xué)研究[J].現(xiàn)代食品科技，2014（10）：154-158.

[12]GB/T 13267—1991.水質(zhì)?物質(zhì)對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法[S].

[13]左甜甜，李耀磊，金紅宇，等.ICP-MS法測定18種動物藥中重金屬及有害元素的殘留量及初步風(fēng)險分析[J].藥物分析雜志，2017（2）：61-66.

[14]張振燕，張美琴，吳瑛.重金屬Cd與Cu在克氏原螯蝦體內(nèi)富集與釋放規(guī)律[J].食品科學(xué)，2014，35（17）：250-254.

[15]Wang Z，Wang X，Ke C.Bioaccumulation of trace metals by the live macroalga Gracilaria lemaneiformis[J].Journal of Applied Phycology，2014，26（4）：1889-1897.

[16]P.-E L，C.-K L，Din Z.The kinetics of bioaccumulation of zinc，copper，lead and cadmium by oysters （Crassostrea iredalei and C.belcheri）under tropical field conditions[J].Science of the Total Environment，1998，216（1-2）：147-157.

（責(zé)任編輯?唐建敏）