付傳明　冼康華　蘇江　何金祥　黃寧珍

摘要：? 該文以廣西野生金線蓮無菌播種離體莖段為材料，采用單因素對比試驗，研究了植物激素（NAA、IBA、6-BA、GA3、KT、ZT、TDZ、2-IP）以及接種方式（豎直接種和水平接種）對壯苗生根培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：與對照相比，生長素有利于壯苗生根，NAA的效果優(yōu)于IBA;細(xì)胞分裂素對壯苗生根的效果依次為6-BA>TDZ>KT=ZT>2-IP>CK，其中6-BA誘導(dǎo)平均株高8.4 cm，3.6條根，莖粗為2.84 mm，植株生長健壯，誘導(dǎo)效果最好;赤霉素GA3誘導(dǎo)出的植株高且直，但植株細(xì)弱，且抑制根系生長，不利于壯苗生根培養(yǎng);在激素組合6-BA 0.5 mg·L-1、NAA1.0 mg·L-1處理中，組培苗生長健壯且根數(shù)量較多，效果最佳;水平接種能誘導(dǎo)出更多的根系，且便于接種操作，可以節(jié)省接種時間。因此，確定廣西金線蓮最適宜的壯苗生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+香蕉汁100 g·L-1+AC（活性炭）1.0 g·L-1+蔗糖20 g·L-1，最佳接種方式為水平接種。

關(guān)鍵詞： 植物激素， 接種方式， 廣西金線蓮， 組培苗， 壯苗生根

中圖分類號：? Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2019）12-1628-08

作者簡介： 付傳明（1980-），男，湖北公安人，副研究員，主要從事植物生物技術(shù)和珍稀瀕危植物保育研究工作，（E-mail） 470196422@qq.com。

Abstract：? Selecting stem segments of wild Guangxi Anoectochilus roxburghii as the study object， single factor comparison was carried out to determine the effects of phytohormone （NAA， IBA， 6-BA， GA3， KT， ZT， TDZ， 2-IP） and inoculation method（vertical inoculation? and horizontal inoculation） on cultivating strong seedling and inducing root. The results showed that compared to control treatment， NAA was better than IBA in cultivating strong seedling and inducing root. And the effects of cytokinins were as 6-BA >TDZ>KT=ZT> 2-IP >CK. The average height of seedlings in 6-BA treatment was 8.4 cm， the average root number was 3.6， the stem diameter was 2.84 mm， all seedlings grown vigorously with the best inducing effect. Gibberellin GA3 could induced seedlings tall and straight， but it could not make seedling strong and it inhibited the growth of roots. The combination of 6-BA 0.5 mg·L-1 and NAA 1.0 mg·L-1 generated a good effect， which could induce strong seedlings and numerous roots. Horizontal inoculation? could induce numerous roots， and it was convenient for operation and saved time of inoculation. Therefore， it can be concluded that during the strong plant culture and root inducing of Guangxi Anoectochilus roxburghii， the optimum medium is 1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1 +NAA 1.0 mg·L-1+banana mud 100 g·L-1+ AC 1.0 g·L-1+ sugar 20 g·L-1， and the best inoculating method is to inoculate horizontally.

Key words： phytohormone， inoculation method， Guangxi Anoectochilus roxburghii， in vitro shoots， cultivating strong seedling and inducing root

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）屬蘭科開唇蘭屬的珍稀名貴藥用和觀賞植物，在我國主要分布于福建、云南、廣西、廣東和江西等?。▍^(qū)）。作為我國傳統(tǒng)的珍貴藥材（羅曉青等，2011），金線蓮素有“神藥”“金草”“藥王”“烏人參”等美稱，全草均可入藥，在民間對治療急慢性肝炎、高血脂、糖尿病等多種重大疾病均有療效。金線蓮除用作中藥材外，還大量用于煲湯和制茶，在日本、中國臺灣已開展了金線蓮藥用多糖提取加工，且產(chǎn)業(yè)化達(dá)到一定的規(guī)模，由此可見，金線蓮擁有非常好的市場前景。廣西是我國野生金線蓮的原生主產(chǎn)地之一，產(chǎn)自廣西的金線蓮原生居群外形優(yōu)美、藥用成分含量高，是優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源（陳裕等，1994;孔祥海，2001）。但是，由于金線蓮生長習(xí)性獨特，加上人為肆意采挖，使其資源枯竭問題日漸突出。

通過組培工廠化繁育金線蓮種苗進(jìn)行移栽種植，已成為金線蓮人工種植的發(fā)展趨勢，其中壯苗生根培養(yǎng)是組培苗移栽成活的關(guān)鍵階段，在金線蓮工廠化繁育種苗過程中尤為重要。目前關(guān)于金線蓮組培繁育已有較多研究報道，通常以單株芽苗為壯苗生根培養(yǎng)的接種材料，采用豎直接種的方式，使用的植物激素以生長素類物質(zhì)為主，盡管也能快速誘導(dǎo)植株生根并獲得較高的根系誘導(dǎo)率，但仍存在植株細(xì)弱不健壯，主根系不發(fā)達(dá)等問題（韓曉紅等，2012;王麗芳，2012;王雅英等，2005）。針對這些問題，本試驗在前期開展廣西金線蓮無菌播種培養(yǎng)的基礎(chǔ)上（付傳明等，2018），選取離體莖段為試驗材料，從接種方式和培養(yǎng)基激素種類濃度配比方面對壯苗生根進(jìn)一步優(yōu)化，確定出最佳的接種方式及培養(yǎng)基配方，旨在為廣西金線蓮大規(guī)模工廠化育苗提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料和試劑

材料：廣西金線蓮野生植株引自廣西桂林、賀州、柳州等地區(qū)。引種到廣西桂林的蘭花良種培育中心種質(zhì)圃內(nèi)，進(jìn)行人工授粉和無菌播種培養(yǎng)，選取粗細(xì)基本一致、高5～7 cm、具3～4節(jié)的離體試管苗，去掉葉片和頂芽后，剪成1.5～2.5 cm長的帶1個節(jié)的莖段為供試材料。

試劑：所用植物激素IBA （Indole-3-Butytric acid）、NAA （Naphthalene acetic acid）、6-BA （6-benzylaminopurine）、ZT （6-Furfurylaminopurine）、TDZ （Thidiazuron）、2-IP? [6（△isopenylamino） purine]、KT （kinetin）、GA3 （Gibberellin A3）均為分析純，購買于上海Sigma公司或國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度和種類植物激素配比設(shè)置將莖段材料分別接種到固定的基準(zhǔn)培養(yǎng)基1/2MS+香蕉汁100 g·L-1+AC（活性炭）1.0 g·L-1+蔗糖2 g·L-1上，添加不同種類和濃度植物激素的壯苗生根培養(yǎng)基中。設(shè)計的4個對比試驗如下：① 添加不同濃度的NAA（0、0.5、1.0、1.5 mg·L- 1）和IBA（0、0.5、1.0、1.5 mg·L-1），比較生長素種類對壯苗生根的影響，篩選出較適宜的生長素種類。② 通過預(yù)試驗，已確定了各種細(xì)胞分裂素物質(zhì)的適用濃度范圍。因此，本試驗選擇5種細(xì)胞分裂素及適用濃度6-BA（1.0 mg·L-1）、TDZ（0.5 mg·L-1）、KT（1.0 mg·L-1）、ZT（0.5 mg·L-1）、2-IP（0.5 mg·L-1）進(jìn)行對比，篩選確定出最適宜的細(xì)胞分裂素種類。③ 添加不同濃度的赤霉素GA3（0、0.2、0.5、1.0 mg·L-1），比較不同濃度GA3對壯苗生根的影響。④ 將篩選出的較適宜生長素NAA（濃度設(shè)為0、0.5、1.0、1.5 mg·L-1）與細(xì)胞分裂素6-BA（濃度設(shè)為0、0.2、0.5、1.0、2.0 mg·L-1）進(jìn)行配比試驗，比較壯苗生根效果，優(yōu)化出最佳的壯苗生根培養(yǎng)基配方。每個處理接種10瓶，每瓶接種20個莖段材料，定期觀察并記錄根系和腋芽發(fā)生過程，培養(yǎng)90 d后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.2 接種方式的選擇與處理在超凈工作臺內(nèi)，接種操作時選擇豎直接種（按植株生長方向?qū)⒐?jié)以下部分莖稈豎直插入培養(yǎng)基內(nèi)）與水平接種（將莖段平鋪在培養(yǎng)基表面）2種方式，比較分析不同接種方式對廣西金線蓮壯苗生根的影響。

1.2.3 培養(yǎng)基的配置和培養(yǎng)環(huán)境根據(jù)前期試驗篩選的結(jié)果，本試驗所用培養(yǎng)基均以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加香蕉汁100 g·L-1（去掉皮后放入榨汁機(jī)內(nèi)加水打勻成汁）、活性炭1.0 g·L-1、蔗糖20 g·L-1、瓊脂粉3.5 g·L-1，pH值調(diào)節(jié)至5.8，分裝后于121 ℃、105 Pa條件下滅菌25 min，待培養(yǎng)基冷卻后進(jìn)行試驗，在溫度（25±3） ℃、光照強度20～30 μmol·m-2·s-1、光照時間12 h·d-1的條件下培養(yǎng)。

1.3 結(jié)果觀測和數(shù)據(jù)處理

株高：將組培苗從養(yǎng)瓶中取出，用直尺量取每株苗的株高，計算平均高度。根數(shù)及根長：將組培苗用清水洗凈培養(yǎng)基后，數(shù)每株苗的根條數(shù)，包括節(jié)上的氣生根和基部的根，并用直尺量取每條根的長度，然后計算平均根數(shù)和平均根長。

生根率=（具有根系的植株數(shù)/植株總數(shù)）×100%。

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素的方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1 生長素種類對廣西金線蓮壯苗生根培養(yǎng)的影響

廣西金線蓮離體莖段接種到含不同濃度NAA和IBA的基準(zhǔn)培養(yǎng)基上，接種10 d后，可見節(jié)部開始萌動突起，形成乳白色顆粒狀氣生根原基，隨后逐漸伸長成為氣生根。同時節(jié)上腋芽原基開始萌發(fā)形成芽尖，并逐漸向上生長形成具莖、葉、節(jié)（下部節(jié)每節(jié)具1氣生根）、根（包括氣生根和基部根）的完整植株。

培養(yǎng)至90 d時的結(jié)果見表1，由表1可知，金線蓮在各培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)腋芽生長和生根，生根率達(dá)到100%。在株高和根數(shù)量方面，NAA處理的根數(shù)最多，優(yōu)于IBA和對照處理，其中NAA 1.0 mg·L-1處理誘導(dǎo)的根多且較長，平均根數(shù)為5.7，植株株高最高，達(dá)7.7 cm，植株生長健壯。因此，在使用生長素時，選擇NAA較好。

2.2 細(xì)胞分裂素對廣西金線蓮壯苗生根培養(yǎng)的影響

在基準(zhǔn)培養(yǎng)基上添加不同種類的細(xì)胞分裂素，表 26-BA、TDZ、KT、ZT、2-IP對廣西金線蓮壯苗生根的影響均使用前期試驗確定的適用濃度，誘導(dǎo)廣西金線蓮壯苗生根培養(yǎng)結(jié)果見表2和圖1。由表2和圖1可知，6-BA培養(yǎng)基上的壯苗生根培養(yǎng)效果最好，植株生長健壯，平均株高達(dá)8.4 cm為最高，莖粗2.84 mm也為最粗;TDZ培養(yǎng)基株高一般，平均為7.5 cm，但平均3.9條根為最多，且莖粗（2.62 mm）僅次于6-BA;KT和ZT培養(yǎng)基上植株的株高、根數(shù)及莖粗居中，植株相對較直;2-IP培養(yǎng)基上根數(shù)和株高均一般，僅高于對照處理。因此，綜合比較植株生根和健壯情況，使用細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)培養(yǎng)排列順序為6-BA>TDZ>KT=ZT>2-IP>CK，以6-BA為最好。

2.3 不同濃度赤霉素對廣西金線蓮壯苗生根培養(yǎng)的影響

在基準(zhǔn)培養(yǎng)基上，添加不同濃度的赤霉素GA3，誘導(dǎo)廣西金線蓮壯苗生根培養(yǎng)結(jié)果見表3和圖2。從表3和圖2可以看出，添加赤霉素GA3培養(yǎng)基上植株莖稈較直，莖節(jié)較長，株高和莖節(jié)長顯著高于對照（P<0.05），但莖粗和生根率卻明顯不如對照（基準(zhǔn)培養(yǎng)基），且隨著GA3使用濃度的升高，莖粗和生根率均下降，植株葉片變小，色嫩綠，不如對照健壯，表明赤霉素GA3對根系和莖粗生長具有抑制作用，因此，在廣西金線蓮的壯苗生根培養(yǎng)中不宜使用赤霉素GA3。

2.4 生長素與細(xì)胞分裂素配比對廣西金線蓮壯苗生根的影響

從前述研究結(jié)果得出，生長素NAA和細(xì)胞分裂6-BA對誘導(dǎo)廣西金線蓮壯苗生根培養(yǎng)效果較好，因此采用4種濃度的6-BA與3種濃度的NAA兩兩組合配比，以基準(zhǔn)培養(yǎng)基作為對照（6-BA 0 mg·L-1+NAA 0 mg·L-1），共設(shè)計了13個不同配方的培養(yǎng)基（編號為1-13），培養(yǎng)90 d后，各激素組合對生根率、根長、株高的影響結(jié)果見表4。

由表4可知，廣西金線蓮莖段接種到各培養(yǎng)基上都能誘導(dǎo)節(jié)或基部生根，生根率達(dá)到100%;在根長方面，6號培養(yǎng)基（激素配比為6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1）的平均根長最長，可達(dá)3.17 cm，且根條數(shù)和根粗壯度也較好。在植株株高方面，各培養(yǎng)基上差異不明顯，但粗壯度和植株色澤存在差異，其中3、6、9號培養(yǎng)基上植株葉片舒展，色澤較好，植株相對更加健壯。綜合考慮，可以選擇培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+香蕉汁100 g·L-1+AC 1.0 g·L-1+蔗糖20 g·L-1作為廣西金線蓮的適宜壯苗生根培養(yǎng)基。

2.5 不同接種方式對廣西金線蓮壯苗生根的影響

在廣西金線蓮的組培快繁中，以莖段為接種材料進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，采用豎直接種和水平接種2種方式均可誘導(dǎo)植株和根系生長（表5，圖3），其中水平接種誘導(dǎo)的平均根條數(shù)為5.6條，顯著高于豎直接種的4.6條（P<0.05），2種方式的平均株高分別為7.9 cm和8.2 cm，差異不顯著（P>0.05）。由于水平接種方式在操作簡便和節(jié)省時間方面好于豎直接種方式，因此，綜合考慮植株生長和接種操作情況，在以莖段為接種材料進(jìn)行廣西金線蓮工廠化繁育中，水平接種為壯苗生根培養(yǎng)適宜的接種方式。

3討論

在以往關(guān)于金線蓮壯苗生根培養(yǎng)的報道中，通常以單株芽苗為接種材料，都存在莖桿較細(xì)弱、根系不發(fā)達(dá)的問題。如在福建金線蓮（孟志霞等，2008）、海南金線蓮（唐賽等，2015）、廣東金線蓮（胡位榮等，2017）生根培養(yǎng)中，均以具有頂芽和2～3個莖節(jié)的單株芽苗為材料進(jìn)行生根培養(yǎng)，盡管誘導(dǎo)根系速度較快，但同時也誘導(dǎo)出了較多的細(xì)弱側(cè)芽苗，導(dǎo)致植株葉片難以舒展生長，在有限營養(yǎng)培養(yǎng)基上，故植株不健壯，根系也不發(fā)達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，選取粗壯莖段為接種材料在增加金線蓮粗壯度方面更具優(yōu)勢，這可能是因為粗壯莖段較頂芽和單株芽苗發(fā)育程度不同，并且內(nèi)源激素含量和比例也不同，尤其是活性內(nèi)源激素含量不同。因此，通過誘導(dǎo)莖節(jié)腋芽原基和根原基萌發(fā)生長，每個莖段材料再生獲得一株完整植株，植株更加健壯、齊整，根系更加發(fā)達(dá)。

大多數(shù)研究結(jié)果表明，植物激素是影響試管苗離體再生的主要因素，其中細(xì)胞分裂素是不定芽再生的關(guān)鍵激素，生長素是誘導(dǎo)不定根發(fā)生過程中根尖分生組織形成的關(guān)鍵要素。在本研究中，細(xì)胞分裂素與生長素配比對廣西金線蓮誘導(dǎo)壯苗生根起重要作用，這與以往生根培養(yǎng)側(cè)重于誘導(dǎo)出根系而偏向于使用生長素不同，如王小敏等（2015）和王禹等（2017）在金線蓮生根培養(yǎng)中均僅使用生長素IBA或NAA，盡管也能夠獲得較高的生根率，但根系不發(fā)達(dá)，壯苗效果也不理想。推測金線蓮不定根再生過程同樣需要細(xì)胞分裂素的極性運輸，以解決離體材料不定芽多代繁育后復(fù)壯能力下降的問題。也進(jìn)一步表明，生長素與細(xì)胞分裂素共同協(xié)同作用，一方面能誘導(dǎo)腋芽和根系的快速萌發(fā)，縮短腋芽原基和根原基的啟動周期，另一方面可促進(jìn)腋芽和根系協(xié)同生長，使獲得的植株健壯、齊整。

本研究發(fā)現(xiàn)，在廣西金線蓮的壯苗生根培養(yǎng)階段，以粗壯莖段為接種材料，接種方式也是影響試管苗離體再生的關(guān)鍵之一。我們采用水平接種方式，一方面誘導(dǎo)出的根系條數(shù)更多，這可能是由于接種材料的水平放置，在一定程度上增加了接種材料與培養(yǎng)基的接觸面積，接種材料對營養(yǎng)元素有了更好的吸收，促進(jìn)了根系的生長;另一方面，水平接種方式在接種操作時，不需要區(qū)分接種材料的上下端順序，只需要將材料平放在培養(yǎng)基上，因此在接種操作方面更加簡便、省時，在開展規(guī)模化繁育時更具優(yōu)勢，對生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

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