孫露 田文楊 叢佳林 白穎 黃舉凱 程淑莉 張力 吳淑馨 孫宏峰 楊曉暉

摘要? 目的：探討益消方對(duì)糖尿病KKAy小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響。方法：24只雄性KKAy小鼠隨機(jī)分為模型組及中藥組，12只雄性C57BL/6J小鼠為正常組。中藥組予以中藥復(fù)方益消方灌服，模型組及正常組予灌服等量蒸餾水，在灌胃4周和8周后分別進(jìn)行Morris水迷宮觀察。采用Morris水迷宮圖像自動(dòng)采集和軟件分析系統(tǒng)記錄逃避潛伏期、游泳軌跡、圓臺(tái)穿越次數(shù)、初始角度等。結(jié)果：定位航行試驗(yàn)中，與正常組比較，灌胃4周、8周后模型組逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）;灌胃8周后，中藥組逃避潛伏期在訓(xùn)練第4、5天時(shí)與模型組比較明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）?？臻g探索試驗(yàn)中，灌胃8周后模型組目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比、圓臺(tái)穿越次數(shù)較4周后有所減少，且與正常組及中藥組差距增加，初始角度與正常組比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。結(jié)果顯示益消方縮短糖尿病動(dòng)物模型小鼠逃避潛伏期，增加原圓臺(tái)穿越次數(shù)及目標(biāo)象限游泳時(shí)間。結(jié)論：益消方具有一定延緩糖尿病小鼠認(rèn)知功能障礙發(fā)生進(jìn)程的功效，改善其學(xué)習(xí)記憶行為。

關(guān)鍵詞? 益消方;KKAy小鼠;Morris水迷宮;認(rèn)知功能;自發(fā)性糖尿病;模型

Effects of Yixiao Decoction on the Cognitive Function of KKAy Mice with Spontaneous Diabetes Mellitus in Morris Water Maze

Sun Lu，Tian Wenyang，Cong Jialin，Bai Ying，Huang Jukai，Cheng Shuli，Zhang Li，Wu Shuxin，Sun Hongfeng，Yang Xiaohui

（Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

Abstract Objective： To observe the improve effects of traditional Chinese medicine （TCM） Yixiao Decoction on learning，memory behavior of the KKAy mice. Methods： A total of 24 male KKAy mice were randomly divided into model group and TCM group.A total of 12 male C57BL/6J mice were normal group.The mice of different groups were treated with relevant medicinal respectively by intragastrical method，as the TCM group were fed with Yixiao Decoction.The model group and normal group were fed with distilled water.All groups of mice were performed Morris water maze behavior test respectively when the finish of gavage for 4 and 8 weeks.The Morris water maze′s tracking and analytic system of the experiential animal trace was adopted to record the escape latency，the swimming trajectory of the space exploration test，times across the platform and initial angle，etc. Results： Compared with the normal group，the escape latency of the model group was obviously increased at 4 and 8 weeks after intragastric administration （ P <0.05=.And the Chinese medicine group was shorter than that of the model group on the 4th and 5th day after 8 weeks of gastric administration （ P <0.05=.In the space exploration test，the percentage of time in target quadrant and the crossing times of model group decreased after 8 weeks in contrast with 4 weeks.The difference between the model group and normal group，traditional Chinese medicine group was increased and the initial angle was significantly increased compared with normal group （ P <0.05=.The results showed that Yixiao Decoction could shorten the escape latency of diabetic mice，increase the number of times of traversing the original platform and swimming time in the target quadrant. Conclusion： Yixiao Decoction has the effects of delaying the occurrence of cognitive impairment in diabetic mice and improving their learning and memory behavior.

Key Words? Yi Xiao Decoction; KKAy mice; Morris water maze; Cognitive function; Spontaneous diabetic; Model

中圖分類號(hào)：R587.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.017

國(guó)內(nèi)外研究[1-2]已顯示糖尿病是導(dǎo)致認(rèn)知功能下降和癡呆的重要危險(xiǎn)因素，糖尿病認(rèn)知功能障礙（Diabetic Cognitive Impairment，DCI）是糖尿病嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病率為25% ～36%[3]。糖尿病患者與普通人群相比發(fā)生癡呆的風(fēng)險(xiǎn)較高[4]，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能減退等方面，給患者及家屬的生活帶來(lái)不便。糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病原因及潛在機(jī)制目前尚不明確，亦缺乏特異性的防治措施，而我國(guó)糖尿病患者人數(shù)眾多、醫(yī)療負(fù)擔(dān)較重，因而尋求早期干預(yù)及治療方法具有重要意義[5]。

目前有關(guān)糖尿病腦病的實(shí)驗(yàn)研究顯示多種中藥及有效成分如三七總苷[6]、黃芪多糖[7]、夏枯草[8]、大黃酚[9]等具有抗氧化、抗炎、抗衰老、減少神經(jīng)元損傷等腦保護(hù)作用。中藥復(fù)方益消方由黃芪、三七、夏枯草等中藥組成，前期研究提示[10]該方可改善自發(fā)性KKAy糖尿病小鼠的糖脂代謝紊亂，還具有減少神經(jīng)元損傷、延緩神經(jīng)元減少的作用。本研究主要探討運(yùn)用Morris水迷宮觀察中藥復(fù)方益消方對(duì)糖尿病動(dòng)物模型小鼠在學(xué)習(xí)記憶行為方面的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 12只13周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠和30只13周齡雄性SPF級(jí)KKAy小鼠，均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK京2014-0004，于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)，C57BL/6J小鼠予普通飼料喂養(yǎng)，KKAy小鼠予高脂飼料（許可證號(hào)：SCXK京2014-0008）（含豬油、蔗糖、蛋黃粉、玉米、大豆油等組分）喂養(yǎng)，均自由飲食。經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，斷尾取血測(cè)KKAy小鼠空腹血糖，以2次空腹血糖值均高于13.9 mmol/L為糖尿病模型判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 12只C57BL/6J小鼠為正常組，隨機(jī)分為灌胃4周和8周組（各6只）。隨機(jī)選取糖尿病模型KKAy小鼠24只，分模型組和中藥組（各12只）;再各自隨機(jī)分為2個(gè)小組，即灌胃4周和灌胃8周組（各6只）。中藥復(fù)方益消方由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房提供。KKAy小鼠等效劑量給藥量按臨床成人每公斤體質(zhì)量用藥量的10倍計(jì)算，中藥組按7.7 g/（kg·d）灌服益消方，模型組、正常組灌服同等體積蒸餾水，在灌胃4、8周后進(jìn)行水迷宮測(cè)試。

1.2.2 Morris水迷宮行為測(cè)試 水迷宮為一直徑1.2 m、高0.5 m、深0.3 m的不銹鋼圓形水池，水池第一象限內(nèi)放入直徑9 cm的圓臺(tái)，置于水面下1 cm。池水中加入鈦白粉，混勻呈乳白色，以使動(dòng)物視覺(jué)無(wú)法辨認(rèn)池內(nèi)站臺(tái)位置，池內(nèi)水溫25～27 ℃。計(jì)算機(jī)攝像系統(tǒng)自動(dòng)監(jiān)測(cè)小鼠在水池中的游泳情況，并通過(guò)軟件分析獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。整個(gè)水迷宮測(cè)試連續(xù)6 d，分定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)2個(gè)階段。

1.2.2.1 定位航行試驗(yàn) 歷時(shí)5 d，第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練，再進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。第2天至第5天為定位航行實(shí)驗(yàn)，每天訓(xùn)練2次，4個(gè)象限的入水點(diǎn)每次隨機(jī)選一處將小鼠面朝池壁放入池水，記錄120 s內(nèi)小鼠從入水到尋到圓臺(tái)所用的時(shí)間為逃避潛伏期。若小鼠在120 s內(nèi)未能找到圓臺(tái)，引導(dǎo)至站臺(tái)放置30 s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)和記憶，此時(shí)逃避潛伏期記為120 s。在訓(xùn)練及測(cè)試過(guò)程中圓臺(tái)位置保持不變。

1.2.2.2 空間探索試驗(yàn) 第6天撤除圓臺(tái)，隨機(jī)選一入水點(diǎn)將小鼠面朝池壁入水，系統(tǒng)自動(dòng)記錄120 s內(nèi)小鼠：1）游泳軌跡;2）目標(biāo)象限（第一象限）滯留時(shí)間占總時(shí)間百分比;3）初始角度：小鼠軀體長(zhǎng)軸指向與站臺(tái)中心的夾角（°），數(shù)值越小表示學(xué)習(xí)記憶能力越高;4）穿越圓臺(tái)位置的次數(shù)，評(píng)估小鼠空間記憶能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（? ±s ）表示，多組樣本間差異的比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），2組間均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行試驗(yàn) 逃避潛伏期用于檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力，時(shí)間越短能力越強(qiáng)，反之則越弱。經(jīng)過(guò)1天的適應(yīng)性訓(xùn)練，第2天開(kāi)始灌胃4周（即18周齡）的模型組與正常組比較，逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），說(shuō)明模型組小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)和記憶能力的受損，且隨著病程延長(zhǎng)，逃避潛伏期增加，空間學(xué)習(xí)記憶能力受損程度逐漸加劇;中藥組逃避潛伏期至灌胃8周后訓(xùn)練第4、5天即與正常組差距逐漸縮短，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），中藥灌胃8周（即22周齡）后較4周組逃避潛伏期無(wú)明顯增加。見(jiàn)表1。提示灌胃中藥復(fù)方益消方對(duì)KKAy小鼠的認(rèn)知損害具有一定程度的改善作用。

2.2 空間探索試驗(yàn) 撤除圓臺(tái)后灌胃4周、8周后各組小鼠游泳軌跡圖分別見(jiàn)圖1、圖2，各組目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比比較及其誤差條形圖分別見(jiàn)表2、圖3，初始角度及穿越圓臺(tái)次數(shù)比較及其誤差條形圖分別見(jiàn)表3、圖4。

經(jīng)過(guò)4 d定位航行試驗(yàn)之后，小鼠對(duì)水迷宮圓臺(tái)的空間位置有了不同程度的記憶，撤除圓臺(tái)后，系統(tǒng)記錄的游泳軌跡反映小鼠對(duì)尋找圓臺(tái)的不同搜索策略。圖1、圖2及表2顯示，正常組小鼠在目標(biāo)象 限內(nèi)的尋找路程和時(shí)間較其他象限均長(zhǎng);模型組目標(biāo)象限游泳路程及時(shí)間較正常組、中藥組均短，其對(duì)原圓臺(tái)記憶能力與中藥組比較有一定差距;圖3顯示，灌胃8周后中藥組與正常組的目標(biāo)象限時(shí)間占總時(shí)間百分比的差距較4周組有所減小，而模型組與正常組的差距加大。表3、圖4顯示，灌胃8周后模型組與正常組中初始角度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），而中藥組初始角度與穿越圓臺(tái)次數(shù)較模型組均有一定改善。

3 討論

Morris水迷宮是20世紀(jì)80年代由英國(guó)生理學(xué)家Morris設(shè)計(jì)并應(yīng)用于評(píng)估嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的重要工具[11]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于認(rèn)知功能方面的研究。王憲玲等[12]對(duì)KKAy糖尿病小鼠早期認(rèn)知功能Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)病6周時(shí)小鼠輕度認(rèn)知功能障礙已出現(xiàn)，發(fā)病12周時(shí)認(rèn)知受損明顯加重，并認(rèn)為KKAy小鼠可作為研究糖尿病腦病的一種較好的動(dòng)物模型。張靜[13]在研究自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠的認(rèn)知功能障礙時(shí)，發(fā)現(xiàn)18周齡的小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙。Yin H等[14]研究自發(fā)性肥胖2型糖尿病KKAy小鼠認(rèn)知功能改變及隨病程的變化，對(duì)3、5和7個(gè)月齡的KKAy小鼠認(rèn)知檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KKAy小鼠在3個(gè)月齡時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試中顯示有認(rèn)知缺陷。有關(guān)KKAy小鼠認(rèn)知功能的研究表明其糖尿病發(fā)病6周時(shí)已出現(xiàn)認(rèn)知功能的損害，并隨著病程的延長(zhǎng)程度逐漸加重。本實(shí)驗(yàn)研究選擇10～12周齡的KKAy小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，灌胃4周和8周進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)18周齡（發(fā)病5周以上）小鼠已出現(xiàn)了認(rèn)知功能的損害，與現(xiàn)有研究結(jié)論基本一致。

《靈樞·五變》謂“五臟皆柔弱者，善病消癉”，消癉即為糖尿病并發(fā)癥。《圣濟(jì)總錄》有關(guān)糖尿病認(rèn)知受損的記載：“消渴日久，健忘怔忡”，提示消渴病日久會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能的障礙。國(guó)醫(yī)大師呂仁和教授認(rèn)為[15]“癥瘕積聚”是糖尿病并發(fā)癥期（中醫(yī)消癉期）的主要病理因素，病位在于肌膚、血脈，由于五臟柔弱、陳氣久積不化、怒氣上逆致血脈不行，化生熱毒、熱消肌膚，繼而產(chǎn)生諸種病癥，治療在于調(diào)補(bǔ)氣血陰陽(yáng)、通經(jīng)絡(luò)、活血脈、清熱毒、調(diào)體質(zhì)量，使陰陽(yáng)逐漸平衡，并基于“微型癥瘕”的形成提出“消癥散結(jié)”的治法。中藥復(fù)方益消方是國(guó)醫(yī)大師呂仁和教授學(xué)術(shù)繼承人楊曉暉教授在傳承呂老對(duì)糖尿病并發(fā)癥“微型癥瘕”學(xué)術(shù)思想基礎(chǔ)上，并通過(guò)多年的臨床觀察總結(jié)而創(chuàng)制，提出氣虛血瘀、阻滯腦竅、絡(luò)脈瘀阻是糖尿病腦病的基本病機(jī)，腦絡(luò)微型癥瘕的形成是糖尿病腦病的病理基礎(chǔ)，益氣化瘀通絡(luò)為糖尿病腦病的基本治療原則。益消方具有益氣消癥、化痰散結(jié)、活血通絡(luò)的功效，補(bǔ)氣益陰以充養(yǎng)腦髓，化痰散結(jié)、活血通絡(luò)以消腦竅之癥結(jié)，及早干預(yù)以延緩糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展。

本研究表明，與正常組C57BL/6J小鼠比較，模型組KKAy小鼠至第19周齡時(shí)逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，至第23周齡時(shí)目標(biāo)象限所占時(shí)間比、初始角度和穿越圓臺(tái)次較數(shù)與正常組及中藥組比較雖無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均有認(rèn)知減退的表現(xiàn)，即出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)和記憶能力的損害，并隨著病程的延長(zhǎng)而逐漸加重。Morris水迷宮動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)8周灌服益消方較4周灌服可有效提高2型糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)和記憶水平，改善認(rèn)知功能障礙。結(jié)合以往益消方的研究成果[3]，益消方可改善糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，改善空間學(xué)習(xí)記憶能力，表明益消方干預(yù)后可有效地延緩糖尿病小鼠 認(rèn)知功能障礙的發(fā)生進(jìn)程，改善其學(xué)習(xí)能力及記憶能力，但有關(guān)中藥復(fù)方量效關(guān)系及其具體作用環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)尚待進(jìn)一步研究。

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