白妮 劉杰 張紅梅 楊振萍

摘要? 目的：建立清熱解毒口服液的質(zhì)量控制方法。方法：選取薄層色譜法，鑒別連翹、黃柏、梔子、赤芍等主要藥效成分;采用高效液相色譜法測(cè)定方中君藥金銀花的主要藥效成分綠原酸的含量。結(jié)果：確立了清熱解毒口服液中連翹、黃柏、梔子、赤芍的薄層色譜鑒別方法。在選定的高效液相色譜條件下，建立了清熱解毒口服液中綠原酸的含量測(cè)定方法，其方法學(xué)均符合藥典要求。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的定性鑒別和含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于清熱解毒口服液的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞? 清熱解毒口服液;薄層色譜法;高效液相色譜法;綠原酸;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

Study on the Quality Standard of Qingre Jiedu Oral Solution

Bai Ni1，Liu Jie2，Zhang Hongmei1，Yang Zhenping1

（1 Yan ′an Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Yan ′an 716000，China; 2 Yan ′an Disease Prevention and Control Center，Yan ′an 716000，China ）

Abstract Objective： To improve the quality standard of Qingre Jiedu Oral Solution. Methods： TLC （Thin-Layer Chromatography） methods were used for the qualitative identification of Forsythiae Fructus，Cortex Phellodendri，F(xiàn)ructus Gardeniae and Radix Paeoniae Rubra，and HPLC （High Performance Liquid Chromatography） method was used to determine chlorogenic acids of the main drug Flos Lonicerae. Results： Identification method of the TLC about Forsythiae Fructus，Cortex Phellodendri，F(xiàn)ructus Gardeniae and Radix Paeoniae Rubra etc in Oral Solution was established.Under the selected conditions of HPLC，an identification method for chlorogenic acids in Oral Solution was established and the methodology complies with the requirements of Chinese Pharmacopeia. Conclusion： The identification and quantitative determination method is simple，accurate and reproducible，which can be applied to the quality control of Qingre Jiedu Oral Solution.

Key Words? Qingre Jiedu Oral Solution; Thin-Layer Chromatography; High Performance Liquid Chromatography; Chlorogenic acids; Quality standard

中圖分類號(hào)：R289.5;R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.010

清熱解毒口服液由金銀花、連翹、黃連、黃芩、黃柏等10味中藥組成，是延安市中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)根據(jù)多年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒、滋陰瀉火的功效。適用于熱毒內(nèi)盛所致的發(fā)熱面赤，煩燥口渴，咽喉腫痛，身起瘡瘍疔毒，如流感、上呼吸道感染見(jiàn)上述證候者亦可應(yīng)用。該口服液批準(zhǔn)文號(hào)為陜藥管制字[2001]第3686號(hào)，臨床應(yīng)用已有20余載，患者反映良好。

清熱解毒口服液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)目只有綠原酸的薄層色譜鑒別，專屬性差，為完善該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，提高患者用藥安全度，讓患者放心服用該口服液，我們通過(guò)薄層色譜法對(duì)方中主要藥效成分進(jìn)行了定性鑒別研究，最終選取了連翹、黃柏、梔子、芍藥4種分離度較好，斑點(diǎn)清晰，重復(fù)性好的成分列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。此外采用高效液相色譜法測(cè)定方中君藥金銀花的主要藥效成分綠原酸的含量。為嚴(yán)格控制清熱解毒口服液的質(zhì)量，提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了定性定量實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）;超聲波清洗器（上海安寧科學(xué)儀器公司）;BP210S型電子天平（德國(guó)SARTORIUS公司）。ZF-C型三用紫外分析儀（上?？岛坦怆妰x器有限公司）;202-1型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）;HDM-1000數(shù)顯控溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;TG328B分析天平（上海精科天平，精密度0.1 mg）;XY600-2C電子分析天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）;SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），F(xiàn)W-100D高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津鑫博得儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑 甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），超純水。

1.3 分析樣品 綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：161021-201413，99.6%）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：160821-201412，99.7%），梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：160911-201405，99.6%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：160715-201402，99.7%），黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)：160625-201502，99.4%）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;清熱解毒口服液（延安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號(hào)為20170226、20170307、20170412，規(guī)格：10 mL/瓶）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 連翹薄層鑒別 量取3批次清熱解毒口服液各20 mL，用水飽和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，先用氨試液（取濃氨溶液20 mL，加水使成50 mL，即得。）40 mL洗滌，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水40 mL洗滌，分取正丁醇液，蒸干，加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。稱取連翹苷對(duì)照品，用甲醇制成1 mg/ mL對(duì)照品溶液。取樣品中缺連翹的口服液，按制備供試品溶液方法制得陰性樣品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各15 μL、5 μL，點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以氯仿-甲醇（5∶ 1）溶液系統(tǒng)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，噴以10%硫酸乙醇液，加熱（105 ℃）至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的紫紅色斑點(diǎn)。而陰性樣品無(wú)此斑點(diǎn)[1-4]。見(jiàn)圖1。

2.1.2 赤芍薄層鑒別 量取3批次清熱解毒口服液各20 mL，用水飽和的正丁醇40 mL分2次提取，合并正丁醇液，蒸干，用乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。稱取芍藥苷對(duì)照品，用乙醇制成2 mg/mL對(duì)照品溶液。取樣品中缺赤芍的口服液，按制備供試品方法制得陰性樣品溶液。吸取供試品、對(duì)照品溶液各15 μL、5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40.5∶ 10∶ 0.2）溶液系統(tǒng)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，且噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱（105 ℃）至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。而陰性樣品無(wú)此斑點(diǎn)[1-4]。見(jiàn)圖2。

2.1.3 梔子薄層鑒別 量取3批次清熱解毒口服液各20 mL，加乙酸乙酯30 mL，分兩次提取，合并乙酸乙酯液，蒸干用乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。稱取梔子苷對(duì)照品，加乙醇制成2 mg/mL對(duì)照品溶液。取樣品缺梔子的口服液，按制備供試品溶液方法制得陰性樣品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各15 μL、5 μL，點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶ 5∶ 1∶ 1）溶液系統(tǒng)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，以10%硫酸乙醇液為顯色劑，加熱（105 ℃）至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同土紅色的斑點(diǎn)，而陰性樣品無(wú)此斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

2.1.4 黃柏薄層鑒別 量取3批次清熱解毒口服液各20 mL，蒸至10 mL，用濃氨調(diào)pH值至10，用相同體積的氯仿萃取2次，合并氯仿液，蒸干，加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。稱取黃柏對(duì)照藥材0.1 g，加1%醋酸甲醇20 mL，超聲波處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸至2 mL，作為對(duì)照藥材溶液。取樣品中缺黃柏的口服液，按制備供試品溶液方法制得陰性樣品溶液。分別吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液20 μL、10 μL，點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶ 2∶ 5）溶液系統(tǒng)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，以稀碘化鉍鉀為顯色劑，加熱（105 ℃）至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的亮黃色斑點(diǎn)，而陰性樣品無(wú)此斑點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

2.2 綠原酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 島津Shim-pack VP-ODS C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（25∶ 75∶ 1），流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm;在上述色譜條件下，待測(cè)組分達(dá)到了基線分離。理論板數(shù)以綠原酸計(jì)≥6 000，分離度>1.5，進(jìn)樣量20 μL[5-10]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品（5 mg）置于50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解，定容至50 mL，搖勻，備用（每1 mL中含綠原酸100 μg）。

2.2.3 供試品溶液的制備 量取清熱解毒口服液4.0 mL置50 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 精密稱取除金銀花以外的其他藥材，按照口服液制備工藝，制成口服液，再按制備供試品的方法制成陰性對(duì)照樣品。取供試品、對(duì)照品溶液溶液，陰性樣品各20 μL，注入高效液相色譜測(cè)定儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖5。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液，加50%甲醇制成綠原酸濃度分別為4.0、8.0、12.0、16.0、24.0、32.0、48.0 μg/ mL的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。進(jìn)行回歸分析，得綠原酸線性方程為：Y=2.442X+189.14（r=0.9996），表明綠原酸的在4.0～48.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，綠原酸峰面積 RSD 為0.64%。結(jié)果表明，所選儀器精密度優(yōu)良。

2.2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取一份供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣，以綠原酸的峰面積為參考值，結(jié)果綠原酸峰面積 RSD 為0.36%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)清熱解毒口服液（批號(hào)：20170226），按供試品溶液前處理方法制備6份供試品溶液，各進(jìn)樣20 μL測(cè)得綠原酸的平均含量（ n =6）為212.6 μg/ mL; RSD 分別為1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的供試品溶液1 mL，共6份，置10容量瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液1 mL，加50%甲醇稀釋并定容，依法測(cè)定。見(jiàn)表1。

2.2.10 樣品測(cè)定結(jié)果 取不同批號(hào)的清熱解毒口服液3個(gè)批次，按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液注入高效液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，使用外標(biāo)法計(jì)算樣品中綠原酸的含量分別為211.7、212.8、211.2 μg/mL。

3 討論

3.1 薄層鑒別條件篩選 梔子、赤芍的薄層鑒別方法主要參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2010版）（以下簡(jiǎn)稱《藥典》）中梔子、赤芍項(xiàng)下方法，各斑點(diǎn)顯示清晰，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便。連翹薄層鑒別采用藥典方法時(shí)，連翹苷斑點(diǎn)Rf值較小，拖尾嚴(yán)重，經(jīng)參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，調(diào)整展開(kāi)劑比例，以氯仿-甲醇（5∶ 1）為展開(kāi)劑，其展開(kāi)系統(tǒng)樣品的相容性、分離效果均較好，Rf適中，薄層板對(duì)應(yīng)部位連翹苷斑點(diǎn)清晰，呈紫紅色，陰性無(wú)干擾，該鑒別條件簡(jiǎn)簡(jiǎn)單易行，重現(xiàn)性好。黃柏薄層鑒別采用藥典方法時(shí)，斑點(diǎn)顯示不清晰，工藝復(fù)雜，經(jīng)參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-17]，采取正丁醇-冰醋酸-水（7∶ 2∶ 5）溶系統(tǒng)液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，以稀碘化鉍鉀為顯色劑，加熱（105 ℃）至斑點(diǎn)顯色清晰。該方法，樣品分離效果均較好，斑點(diǎn)清晰，Rf值適中。方中其他幾味中藥經(jīng)《藥典》及其他文獻(xiàn)方法，鑒別結(jié)果欠佳，背景通道干擾明顯，斑點(diǎn)分離清晰，后續(xù)將進(jìn)一步研究其他幾味中藥薄層色譜方法，為清熱解毒口服液的質(zhì)量控制提供更好的依據(jù)。

3.2 綠原酸含量測(cè)定研究 綠原酸含量測(cè)定時(shí)，首先選用《藥典》中綠原酸高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，即流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶ 87）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，結(jié)果由于清熱解毒口服液復(fù)方制劑成分復(fù)雜，高效液相色譜圖各組分相互影響，色譜峰分離不清晰，干擾較多，為減少其他色譜峰的干擾，研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)整流動(dòng)相為：甲醇-水-冰醋酸（25∶ 75∶ 1）。另外從清熱解毒口服液的紫外掃描圖分析，得出綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為328 nm。進(jìn)樣量20 μL，其他色譜條件不變，所得的綠原酸色譜峰，分離度優(yōu)良，峰型對(duì)稱，系統(tǒng)適應(yīng)性好，重復(fù)性好，陰性樣品對(duì)照無(wú)干擾[18-27]。由于實(shí)驗(yàn)條件限制，本研究暫測(cè)定主要藥效成分綠原酸的含量，后續(xù)將逐步進(jìn)行其他藥效成分的定性、定量研究，為完善該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，提高患者用藥安全性提供科學(xué)依據(jù)。

中醫(yī)認(rèn)為熱毒內(nèi)盛多因外感風(fēng)熱之邪或內(nèi)有濕火而又外感風(fēng)熱之邪，兩相搏結(jié)，郁而化火。證見(jiàn)高熱口渴，煩躁，咽喉腫痛，或見(jiàn)瘡瘍腫毒。清熱解毒口服液中金銀花苦寒，歸肺、心、胃經(jīng)，其氣味芳香，即善清血分之熱，又可疏散肺經(jīng)風(fēng)熱。連翹苦、微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)，清心而祛上焦諸熱，散結(jié)消腫而治痰。二藥合用，清熱解毒，疏散風(fēng)熱、散結(jié)消腫為君藥。黃連、黃芩、黃柏清熱燥濕，瀉火解毒;諸藥合用共奏清熱解毒，消腫散結(jié)之功，與病機(jī)相符。本研究對(duì)清熱解毒口服液中連翹、赤芍、梔子、黃柏4味中藥進(jìn)行了定性鑒別，所選方法簡(jiǎn)單易行，斑點(diǎn)清晰，分離度好;成分定量測(cè)定分析時(shí)間短，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好。對(duì)方中君藥金銀花中的主要有效成分綠原酸進(jìn)行了含量測(cè)定，其方法學(xué)均符合《藥典》要求，所建立方法較現(xiàn)行清熱解毒口服液標(biāo)準(zhǔn)有較大提高，可初步用于清熱解毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。

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