姜玉素 李珍 王慶蓮 趙密珍 宋志忠
摘要:K+/H+逆向轉運體(KEA)介導細胞中K+和H+的動態(tài)平衡,在維持植物體內(nèi)的離子平衡、生長發(fā)育和信號轉導中起重要作用,然而,相關研究主要體現(xiàn)在模式作物擬南芥中,果樹中KEA家族基因的功能依然未知。本研究以Yellow Wonder 5AF8草莓為材料,篩選并克隆KEA家族基因,并對其進行生物信息學鑒定和表達特征分析,為研究果樹K+/H+平衡及鉀素動態(tài)平衡機制提供基因資源和理論依據(jù)。結果表明,在草莓基因組中檢索并克隆到5個KEA家族基因,命名為FreKEAI~FreKEA5,屬于典型的植物K+/H+逆向轉運體基因;編碼的蛋白質與7種已報道的不同科屬植物的KEA家族蛋白在氨基酸水平上具有25.00%的一致性,并可分為2個亞族(Group I和Group II),其中,草莓FveKEA1和FveKEA2屬于Group I,只含有4個Motif基序,而FveKEA3~FveKEA5屬于Group II,含有7個Motif基序;系統(tǒng)進化樹表明草莓FveKEA2和FveKEA4分別與葡萄VvKEA2和蘋果MdoKEA6緊密聚在一起,草莓FveKEA1、FveKEA3和FveKEA5分別與葡萄VvKEA1、白楊PtrKEA4、桃PpeKEA4等相應成員在遺傳距離上較近;草莓KEA家族蛋白主要定位于細胞質膜,均含有12~14個跨膜區(qū),除FveKEA3外,均為穩(wěn)定蛋白,且只有FveKEA5含有信號肽;轉錄表達譜分析結果揭示草莓KEA家族基因在多種組織或器官中均有表達,實時熒光定量PCR結果表明FreKEAI在5AF8草莓不同組織中的整體表達水平最高,在花瓣和未成熟果實中的表達量最為突出,其次是FveKEA4,而其他3個基因的整體表達水平相對較低。此外,在草莓KEA基因啟動子區(qū)域鑒定到至少16種順式作用元件,且均含有光感應、胚乳表達和脫落酸(ABA)響應的作用元件。
關鍵詞:草莓;K+/H+逆向轉運體;生物信息學分析;基因克隆與表達
中圖分類號:S668.4
文獻標識碼:A
文章編號:1000-4440(2019)02-0391-09
鉀離子(K+)是細胞中含量最為豐富的金屬陽離子之一,控制著細胞基礎膜電位,調(diào)節(jié)細胞滲透平衡,在植物光合作用、蒸騰作用、氣孔開關和信號傳導等多種生命活動中起關鍵作用[1-2]。園藝研究中,鉀素營養(yǎng)與果樹生長發(fā)育、花開放、果實品質和產(chǎn)量等密切相關[3-7],但果樹鉀素營養(yǎng)高效利用的分子基礎研究較少。
CPAs(Cation proton antiporters)定位于細胞質膜液泡膜和線粒體、葉綠體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器膜,是一類廣泛存在于植物、動物、真菌和細菌的陽離子_質子逆向轉運體,可將細胞中的K+、Na+、Li+等陽離子排出,并引起細胞內(nèi)H+的內(nèi)流和積累[8-9],維持細胞K+和H+的動態(tài)平衡。植物中,CPAs介導細胞中離子和pH的穩(wěn)態(tài),在維持植物體內(nèi)的滲透平衡、生長發(fā)育和信號轉導中起重要作用[8-16]。植物CPAs被分為2個亞族:CPA1和CPA2,其中,CPA1亞族主要是NHX(Na+/H+ exchanger)轉運體,CPA2亞族包括KEA(K+ efflux antiporter,K+/H+逆向轉運體)和CHX(Cation/H+ exchanger)轉運體[8-10]。近20年,NHX和CHX的研究報道相對較多,有關KEA亞族的研究最為稀少,主要體現(xiàn)在模式作物擬南芥中,Maser等在2011年最早揭示擬南芥中有6個At-KEA轉運體基因[11],但所有AtKEA基因的功能至今依然沒有完全被解析。最近研究結果表明:擬南芥AtKEA轉運體定位于維管組織、保衛(wèi)細胞和花萼等不同組織部位[12],擬南芥AtKEA1-3轉運體在光合作用、pH調(diào)控及葉綠體滲透調(diào)節(jié)等方面起關鍵作用,并在轉錄水平受外界滲透脅迫、鹽脅迫和ABA脅迫的調(diào)控[13-16]。
果樹中KEA家族基因的功能依然未知,僅見于梨KEA家族基因的克隆及生物信息學分析[17]。草莓[Fragaria resca]是一種全球重要的水果,隨著基因組序列的公布,迅速成為最具研究潛力的園藝作物之一[18]。本研究從草莓中克隆并鑒定了5個KEA家族基因,并通過實時熒光定量PCR分析組織特異性表達特征,為研究果樹鉀素營養(yǎng)與離子動態(tài)平衡提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗材料及取樣
供試材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院草莓資源圃中的草莓Yellow Wonder 5AF8,于2018年3月采樣。所取樣品依次為盛花期草莓植株的根、葉片、花瓣、花藥和草莓發(fā)育不同時期的果實(參照Fait等[19]描述,即:小綠果、白果轉色果、成熟果)。
1.2 草莓KEA基因克隆
以6個擬南芥KEA家族基因(TAIR數(shù)據(jù)庫,http://www.arabidopsis.org/browse/'genefamily/index.jsp)編碼的氨基酸序列為參考,在Phytozome strawberry genome database(http://www.phytozome.net)中檢索草莓基因組中可能的KEA家族基因。檢索結果在Pfam(http://pfam.xfam.org/search)在線服務器預測功能結構域。根據(jù)Phytozome獲得的草莓KEA基因CDS序列(coding sequence),分別設計引物,利用Prime STARTM HS DNA聚合酶(TaKaRa,大連)進行PCR擴增,測序驗證后,用于特異性表達引物設計。
1.3 草莓KEA家族基因生物信息學分析
在草莓基因組數(shù)據(jù)庫中獲得KEA家族各基因的CDS編碼區(qū)序列及基因組DNA序列,然后通過Gene structure display(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)在線服務器進行基因結構分析,利用在線軟件TMpredict(http://ch.embnet.org/sofware/TMPRED_form.html)分析草莓KEA家族蛋白的跨膜結構域,使用在線服務器MEME(v4.8.1)(http://meme-suite.org/tools/meme)預測草莓KEA家族蛋白的保守結構域,使用在線工具ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)評估KEA蛋白成員的理論等電點、分子量、穩(wěn)定性等理化性質,利用在線軟件SignalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)預測KEA家族蛋白的信號肽情況,利用PSORT在線服務器(http://psort.hgc.jp/form.html)預測草莓KEA家族蛋白的亞細胞定位,利用Phyre2在線服務器(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析草莓KEA家族蛋白的三級結構,利用ClustalX 2.0軟件對5個草莓KEA轉運體與梨(12個)、蘋果(7個)、桃(5個)、葡萄(4個)、橙(5個)、楊樹(4個)等已知物種的同源KEA轉運體進行氨基酸序列比對分析[16],用分子進化遺傳分析軟件MEGA7.0中的鄰接法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)進化樹。利用Kang等建立的草莓不同發(fā)育階段的表達譜數(shù)據(jù)庫Strawber-ry Genomic Resources(http://bioinformatics.towson.edu/strawberry/)[18]獲得草莓KEA家族基因在不同組織的表達譜信息。為分析草莓KEA家族基因的啟動子區(qū)域,在Phytozome草莓基因組數(shù)據(jù)庫檢索目的基因CDS區(qū)域起始密碼子ATG的上游1.5kb左右片段的啟動子區(qū)域,并通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht-ml/)在線網(wǎng)站分析草莓KEA啟動子序列中是否含有的cis-順式作用元件。
1.4 實時熒光定量PCR分析
分別采集草莓5AF8不同部位的組織材料,液氮冷凍后-80C冰箱保存,通過MiniBESTPlantRNA Extraction Kit(TaKaRa,大連)提取樣品的總RNA,并利用PrimeScriptTM RT reagent Kit 反轉錄試劑盒(TaKaRa,大連)合成第一鏈cDNA作為模板,用于實時熒光定量PCR。利用NCBI/Primer-BLAST在線服務器,設計草莓KEA基因的特異性表達引物(表1),以草莓Ubiquitin(GenBank No.MH114011)為目的基因,通過ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測KEA基因在草莓植株不同組織的表達特征。熒光染料使用SY BR Green(TaKa-Ra,大連),反應體系參照說明書,反應程序為:95C預變性30s;95°C變性5s,609C退火34s(40個循環(huán));最后72 C延伸10s。每個樣品進行3次重復,不同樣品在實時熒光定量PCR儀獲得相應的Ct值,經(jīng)內(nèi)參基因Actin 均一化處理后,采用2-△OC’法計算基因的相對表達量[20]。
2 結果與分析
2.1 草莓KEA家族基因的篩選與克隆
以6個擬南芥KEA家族基因的氨基酸序列為參考,在Phytozome strawberry genome database(http://www.phytozome.net)草莓基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到5個KEA家族基因,檢索結果在Pfam在線服務器預測到K/H交換結構域(K/H exchanger domain)(PF00999)和TrkA-N domain(PF02254)功能結構域,均屬于典型的KEA家族蛋白。檢索獲得各基因的堿基序列后,以CDS序列起始密碼子ATG和終止密碼子TAG所在位置20 bp左右的序列作為上下游引物,以5AF8草莓幼葉RNA反轉錄獲得的cDNA為模板,PCR擴增各個候選基因的CDS序列,分別連接到pGEM-T載體,轉化大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5a,篩選陽性轉化子送北京擎科生物技術有限公司測序。經(jīng)測序驗證后,獲得草莓5AF8的KEA家族各基因的CDS序列及相應翻譯得到的氨基酸序列,獲得的草莓KEA家族基因分別命名為FveKEAI~FveKEA5。
2.2 7種不同科屬植物KEA家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹
將草莓(薔薇科)、桃(薔薇科)、梨(薔薇科)、蘋果(薔薇科)、葡萄(葡萄科)、橙(蕓香科)、白楊(楊柳科)等7種不同科屬物種的KEA家族基因(表2),通過ClustalX 2.0進行氨基酸水平的多重序列比對。結果表明,供試物種的KEA家族基因之間具有較高的同源性,同源關系較近的兩者之間的序列一致性均高于66.05%;7種植物42個KEA家族成員在氨基酸水平依然具有25.00%的一致性,在核苷酸水平具有25.60%的一致性;5個草莓KEA家族成員在氨基酸水平具有41.88%的一致性(圖1),在核苷酸水平具有40.97%的一致性。利用MEGA 7.0建立系統(tǒng)進化樹,結果表明,7種植物KEA家族成員可分為2個亞族,Group I和Group II,其中,草莓FveKEAI和FveKEA2屬于Group I,而FveKEA3、FreKEA4和FveKEA5屬于Group II(圖1和表3)。此外,7種植物KEA家族基因在遺傳進化關系上有差異,草莓和薔薇科植物(蘋果和桃)、葡萄科葡萄、楊柳科白楊在遺傳距離上是較近的,其中,草莓FveKEA2和FreKEA4分別與葡萄VoKEA2和蘋果MdoKEA6緊密聚在一起,草莓FreKEAI、FveKEA3和FveKEA5分別與葡萄VvKEAI、白楊PtrKEA4桃Ppe-KEA4等相應成員在遺傳距離上較近(圖1)。身為蕓香科植物,橙KEA成員則聚集在一起,與白楊PtrKEAI和PtrKEA2在遺傳距離上較近,且均屬于Group I亞族(圖1)。
2.3 草莓KEA基因及編碼蛋白質特征分析
草莓KEA家族基因主要定位于1號(FveKEA5)、2號(FveKEA2和FrveKEA3)和7號(FveKEAI和FveKEA4)染色體上,含有至少27個長度不一的內(nèi)含子,其中FreKEA3基因擁有最多(34個)的內(nèi)含子數(shù)目(表3);FreKEAI基因CDS編碼區(qū)最長,其次是FveKEA3,F(xiàn)veKEA5最短,其編碼氨基酸數(shù)目和分子量與CDS長度成正比(表2);保守基序分析結果表明草莓FveKEA1含有4個Motif基序(Motif4 ~Motif7),F(xiàn)veKEA2蛋白含有4個Motif基序(Motif2、Motif4、Motif6和Motif7),而FveKEA3、FveKEA4和FveKEA5均含有7個Motif基序,即Motif1~Motif7(圖2和表3)。蛋白質三級結構預測分析結果表明草莓FveKEA1、FveKEA2和FveKEA5擁有相似的三級結構,暗示這3個蛋白質可能擁有相近的功能,而FveKEA3和FveKEA4則分別擁有獨特而差異明顯的三級結構(圖2)。
此外,F(xiàn)veKEA4的等電點(PI)>7.00,其他草莓KEA家族蛋白的等電點均小于7.00,表明FveKEA4含有的堿性氨基酸較多,而其他4個成員的酸性氨基酸較多;草莓KEA家族蛋白均含有12~14個跨膜區(qū),且只有FveKEA5具有信號肽,位于第22~23氨基酸區(qū)域;此外,F(xiàn)veKEA3蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)>40,為不穩(wěn)定蛋白,而其他4個成員均小于40,為穩(wěn)定蛋白(表3)。
2.4 草莓KEA基因啟動子順式作用元件分析
cis-順式作用元件預測結果表明,草莓KEA家族基因啟動子區(qū)域鑒定到至少16種順式作用元件,包括營養(yǎng)和發(fā)育、激素響應、脅迫響應、晝夜規(guī)律等不同生命過程的調(diào)控元件(表4)。其中,3種(光感應、胚乳表達和脫落酸ABA響應)轉錄元件在全部5個FreKEA基因的啟動子中均能預測到,茉莉酮酸甲酯(除FveKEA2基因)和赤霉素(除FveKEA5基因)響應作用元件在4個基因的啟動子區(qū)域能檢測到,水楊酸響應、熱脅迫、厭氧感應、干旱誘導、低溫感應和生長素響應相關的順式作用元件均在不同的3個FrveKEA基因的啟動子區(qū)域出現(xiàn),防御與脅迫、晝夜規(guī)律和真菌激發(fā)子響應相關的順式作用元件均能在不同的2個FveKEA基因的啟動子區(qū)域出現(xiàn),此外,玉米蛋白代謝(FveKEA2)和乙烯響應(FveKEA3)相關的順式作用元件分別在一個FreKEA基因的啟動子區(qū)域鑒定到(表4)。
2.5 草莓KEA蛋白亞細胞定位預測及KEA基因表達譜分析
亞細胞定位預測結果表明草莓FveKEA蛋白主要定位于細胞質膜,其次是內(nèi)質網(wǎng)膜(FveKEA2除外)和液泡膜(FveKEA2和FveKEA5 除外),F(xiàn)veKEA2在葉綠體和線粒體等細胞器的膜上也有檢測到,F(xiàn)veKEA3也定位于核膜上(表5)。
草莓表達譜數(shù)據(jù)庫Strawberry genomic resources檢索結果表明,草莓FveKEA基因在心皮、花藥、果皮、胚、去胚種子、胚珠、子房、花粉、幼苗、花柱、種皮、花粉粒、花瓣、花被和花托等多種組織中均能檢測到(圖3);FveKEAI和FveKEA4的表達量相對較高,其中,F(xiàn)veKEAI主要在花粉粒、花瓣、花被和花托中表達,其次是花藥和幼苗,F(xiàn)veKEA2主要在幼苗中表達,在花粉中表達量極低,F(xiàn)veKEA3主要在子房中表達,F(xiàn)reKEA4主要在花柱、種皮和花藥中表達,F(xiàn)veKEA5表達量較低,在種皮、花粉和胚中均少量表達(圖3)。
2.6 草莓KEA家族基因組織特異性表達分析
熒光定量PCR分析結果表明:FveKEAI~FveKEA5在草莓5AF8不同組織中的表達量有差異,F(xiàn)veKEAI在不同組織中的整體表達水平最高(特別是花瓣中),其次是FveKEA4,其他3個基因在草莓不同組織中的表達水平較為接近,均顯著低于FveKEAI和FveKEA4,與表達譜分析結果基本一致(圖4);在不同組織中,F(xiàn)veKEAI在花瓣和未成熟果實(包括綠果期、白果期和轉色期)中的表達量最高,其次是花藥,花柱中最低;FveKEA2在葉片的表達量最高,其次是根部,在花柱和花藥中的表達量最低;FveKEA3在不同組織中的表達量沒有顯著差異;FveKEA4在花柱和花藥等花器官中的表達水平最高,顯著高于其他組織;FveKEA5在花柱、花藥和未成熟果實(綠果期、白果期及轉色期)中的表達水平較高,顯著高于其他組織(圖4)。
3 討論
植物鉀素營養(yǎng)研究中,KEA轉運蛋白是一類維持體內(nèi)K+/H+動態(tài)平衡并參與滲透調(diào)節(jié)和pH穩(wěn)定的逆向轉運體。有關K+吸收、轉運、卸載和分配的研究較為詳盡[21],而對同時轉運K+和H+的KEA轉運體的研究較少。然而,相關報道主要集中在模式作物擬南芥,果樹作物KEA轉運體的具體功能依然未知。
基因組測序技術的迅速發(fā)展,為果樹作物的科學研究提供了基因資源。本研究從薔薇科植物中克隆并鑒定了5個FveKEA轉運體基因,與薔薇科桃和蕓香科橙中KEA基因成員數(shù)目一致,與葡萄科葡萄和楊柳科白楊接近,而遠低于同屬薔薇科果樹的梨和蘋果,表明,同一家族基因成員的數(shù)目在同一科屬的不同作物之間差異較大,而在相同科屬的不同作物之間可能相同或相近,暗示基因功能的多樣性或差異性。此外,不同物種KEA家族成員在遺傳進化關系上存在差異,草莓和同屬薔薇科植物(蘋果和桃)在遺傳距離上較近,而蕓香科植物橙KEA成員則集中聚集在-起,與薔薇科和葡萄科果樹作物KEA進化關系較遠。在5個草莓KEA轉運體中,F(xiàn)veKEA1和FveKEA2同屬于Group I,且具有相似的Motif和高級蛋白質結構,暗示進化關系上相近的(同一亞族)且具有類似蛋白質Motif基序的2個轉運體之間可能具有相似的功能,而FveKEA3、FveKEA4和FveKEA5同屬于GroupII,且具有7個相同的Motif,但在高級蛋白質結構上差異很大,暗示遺傳關系相近的成員可能在長期進化過程中發(fā)生了不同功能的演變。
Kunz等報道擬南芥AtKEA1~AtKEA3主要定位于細胞質膜_上[13-14,16],本研究中亞細胞定位預測結果表明草莓FveKEA1~FveKEA5主要分布在細胞質膜上,與Kunz等報道相一致。Han等[12]報道指出擬南芥AtKEAI和AtKEA3主要在地上部表達,而其他4個成員基因在植物全身均有表達;Chen等[2]報道GmKEA家族基因在大豆不同組織中均有表達,且差異顯著。本研究熒光定量PCR結果表明草莓KEA家族基因在試驗草莓根部、葉片、花器官和不同發(fā)育期果實等多種組織中均有表達,且與轉錄表達譜分析結果相一致。Zhou等[18]報道梨KEA家族基因在花粉形成不同時期的表達量極低,但沒有研究其在其他組織中的表達特征,與之相應的是,草莓KEA家族基因在盛開期花粉中的表達量相對較低,與之不同的是,草莓KEA家族基因在花藥中均有表達,F(xiàn)veKEAI和FveKEA4較為顯著。特別是,F(xiàn)veKEAI在草莓不同檢測組織中的整體表達水平最高,在花瓣和未成熟果實中尤為突出,推測FveKEAI可能是在花開放和草莓幼果發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的K+/H+逆向轉運體。果實成熟是一個復雜的生物學過程,伴隨各種代謝產(chǎn)物的積累和轉化,而在成熟期草莓果實中,除FrveKEA4外,其他4個基因的表達水平顯著下降,推測這些基因編碼的KEA逆向轉運體的功能在果實成熟時期發(fā)揮的較少,所需的K+較少,有可能將胞內(nèi)的K+外排或者向其他組織(如韌皮部或葉片)轉移,這與同為鉀離子轉運體的KT/HAK/KU家族轉運體類似[23]。
此外,在草莓FveKEAI~FveKEA5啟動子區(qū)域鑒定到多種順式作用元件,且均含有光感應、胚乳特異表達和ABA響應的作用元件,說明多種順式作用元件易與草莓KEA啟動區(qū)的關鍵元件相結合進而調(diào)控KEA家族基因的表達水平。特別地,擬南芥[17]和大豆21中KEA家族基因在轉錄水平易受ABA處理的調(diào)控,本研究中草莓KEA基因啟動子區(qū)域均含有ABA響應的作用元件,暗示該家族基因有類似的滲透響應和調(diào)節(jié)的作用,這為進一步研究草莓KEA轉運體的功能及其調(diào)控機理提供了理論支持。
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