孔維洲　卜寧霞　馬浩然　頡向紅　徐昊　張喜康　劉軍　劉敦華

摘要：以植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和戊糖片球菌為發(fā)酵菌種，通過制備單一和復(fù)合發(fā)酵劑，制作發(fā)酵雞肉干。基于對發(fā)酵雞肉干色澤、水分活度、pH、硬度指標(biāo)的測定，結(jié)合頂空-固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其揮發(fā)性化合物進行分析，研究其在品質(zhì)上的差異，確定出最佳菌種組合。結(jié)果表明，發(fā)酵劑組雞肉干的水分活度.pH值均低于對照組;同對照組雞肉干相比，發(fā)酵劑組的L*值均增大，a*值、b*值均只有2組降低。此外，發(fā)酵劑組雞肉干的硬度顯著低于對照組（P<0.05），揮發(fā)性化合物的種類和相對含量有所增長，結(jié)合感官評分來看，3種菌種混合（1：1：1，發(fā)酵液體積比）發(fā)酵是制作發(fā)酵雞肉干的最佳發(fā)酵劑。

關(guān)鍵詞：復(fù)合發(fā)酵劑;發(fā)酵雞肉干;品質(zhì)特性;風(fēng)味分析

中圖分類號：TS251.4*2

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0453-08

雞肉同牛肉豬肉、羊肉相比，含有較低的脂肪，且肉質(zhì)細嫩、味道鮮美可口，同時，又因其風(fēng)味溫和、接受性強和易于烹飪加工等原因，深受消費者的喜愛[1]發(fā)酵肉干是將發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到肉制品，上的一類新型肉類深加工產(chǎn)品，國內(nèi)外對發(fā)酵肉干的研究多基于牛肉、羊肉和鹿肉，而對禽類如雞肉的研究極少，國內(nèi)對發(fā)酵雞肉干的研究幾乎為空白。人工接種發(fā)酵劑進行肉品發(fā)酵已成為改良傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的主流做法，可提高產(chǎn)品的安全性、感官品質(zhì)和益生性[2]。國內(nèi)外對不同發(fā)酵劑在肉制品_上的應(yīng)用研究十分廣泛，如Montanari等[3]研究了清酒乳桿菌和戊糖片球菌對干發(fā)酵香腸品質(zhì)的影響，Di等[4]人研究了乳桿菌代替亞硝酸鹽，作為保護性發(fā)酵劑抑制發(fā)酵豬肉中梭狀芽胞桿菌的生長，保護產(chǎn)品安全性。發(fā)酵肉制品在內(nèi)源酶和微生物酶的協(xié)同作用下，會在肌肉組織中發(fā)生一系列物理生化變化，均會對發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響。

本研究通過探究植物乳桿菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌的發(fā)酵性能，判斷其應(yīng)用在肉制品上的可行性，并以自然發(fā)酵為對照，利用單一和復(fù)合菌株作為發(fā)酵劑制作發(fā)酵雞肉干，探討不同發(fā)酵劑制作的發(fā)酵雞肉干在理化指標(biāo)和感官指標(biāo)上的變化規(guī)律及差異，篩選出能達到改善發(fā)酵雞肉干嫩度和風(fēng)味、保證產(chǎn)品安全性等目的的發(fā)酵劑組合。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（20265）、戊糖片球菌（20536）、木糖葡萄球菌（21445）均為凍干粉，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.2 儀器與設(shè)備

BSP-250型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);T6新世紀(jì)紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);TDL-5-A型低速臺式大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);FiveEasy plus型pH計，梅特勒_托利多國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn);DP-400型色差儀，柯尼卡美能達公司生產(chǎn);HD-5型水分活度儀，無錫市華科儀器儀表有限公司生產(chǎn);TA-XTai型質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司生產(chǎn);GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司生產(chǎn);DB-5MS毛細管柱，美國Agilent Technolo-gies公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵液的特性測定及制備

1.3.1.1 培養(yǎng)基的制備MRS培養(yǎng)基參照王亞男[5]的制備方法，MSA培養(yǎng)基參照張文娟[6]的制備方法，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基參照何健葉[7]的制備方法，平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基參照GB4789.2-2016的制備方法。

1.3.1.2 菌種生長曲線和產(chǎn)酸特性的測定將乳酸菌（戊糖片球菌和植物乳桿菌）、木糖葡萄球菌的凍干粉分別用MRS培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基于超凈工作臺中活化2次，以1%的接種量接種到150 ml的培養(yǎng)液中，混勻后分裝于試管中放入37C培養(yǎng)箱中。將新鮮培養(yǎng)基設(shè)為對照組，每2h測定試管中菌液的OD值和pH。

1.3.1.3 菌種拮抗作用的測定參照文獻[7]，分別將活化后的菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃1條直線，將培養(yǎng)基置于37C下培養(yǎng)1d，然后以與菌落生長垂直的方向以畫直線的方式再接另一種菌種，注意避開前一種菌種的菌落，在37C條件下培養(yǎng)1d，取出辨別是否有抑菌圈。

1.3.1.4 活菌計數(shù)將1%的活化好的菌種接種至MRS.MSA培養(yǎng)基中，達到對數(shù)生長期后，取出后4000 r/min離心10 min，去除上層液，下層沉淀物用10 ml的無菌生理鹽水懸浮，參考GB4789.2-2010，用系列稀釋和平板計數(shù)法進行活菌計數(shù)，確認計數(shù)結(jié)果符合要求后，即得到可用于生產(chǎn)的發(fā)酵劑。

1.3.2 發(fā)酵雞肉干的制備工藝流程為：原料肉的選擇與預(yù)處理→冷凍→切坯→腌制→發(fā)酵→烘制→包裝→成品。原料肉的選擇與預(yù)處理：選用新鮮、健康的雞胸肉為原材料，注意切除脂肪，浸泡并洗凈。冷凍：修整后放入冰箱，進行冷凍處理，以便于后續(xù)分切。切坯：將雞胸肉沿肌肉纖維方向切成4.0cmx2.0 cmx0.8 cm的肉條待用，肉條應(yīng)厚度均勻且整齊。腌制：肉條中加入2.0%葡萄糖、2.5%鹽.5.0%料酒、2.0%白胡椒粉、2.0%醬油、1.5%味精，在滅菌玻璃罐中充分攪拌后放入4C冰箱中腌制5～6h。發(fā)酵：腌制結(jié)束后，按一定接種比例將1x107CFU/ml的液體發(fā)酵劑均勻注射至肉條中，然后放入到溫度為30C的培養(yǎng)箱中43～44 h。烘制：將發(fā)酵后的肉條在65C烘制3 h，95C烘制1 h，每0.5 h翻1次面，以防止肉干粘連，保證受熱均勻。包裝、成品：待肉干自然冷卻至室溫后進行檢驗，達標(biāo)后包裝即為成品。

分別添加單一和混合菌種（1：1，發(fā)酵液體積比）作為發(fā)酵劑（1x107 CFU/ml，接入量為2%）制作發(fā)酵雞肉干，以自然發(fā)酵劑的雞肉干為對照，試驗設(shè)7個處理組，其中，A組為植物乳桿菌，B組為木糖葡萄球菌，C組為戊糖片球菌，D組為植物乳桿菌+木糖葡萄球菌（1：1，發(fā)酵液體積比），E組為木糖葡萄球菌+戊糖片球菌（1：1，發(fā)酵液體積比），F(xiàn)組為植物乳桿菌+戊糖片球菌（1：1，發(fā)酵液體積比），G組為植物乳桿菌+木糖葡萄球菌+戊糖片球菌（1：1：1，發(fā)酵液體積比）。

1.3.3 發(fā)酵雞肉干品質(zhì)測定利用色差儀測定色澤。每個肉樣隨機測定3個點[8]。利用水分活度儀測定水分。每組樣品測定3次[9]稱取5g樣品，切碎后加入25ml蒸餾水，振蕩攪拌15min，然后用pH計進行測定pH值，每組肉樣測定3次。利用質(zhì)構(gòu)儀測定硬度。測前速：1.0 mm/s，測中速：1.0mm/s，測后速：1.0mm/s，深度：4.0mm探頭型號：P/2N[10]揮發(fā)性物質(zhì)利用頂空-固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定。固相微萃?。喝?g切碎的肉樣置于20 ml頂空瓶中，水?。?0C，20 min），然后用SPME針頭萃取20 min后直接進樣（250C），解析3min。GC和MS條件：參照丁曄[11]的測定條件。用峰面積歸一化法統(tǒng)計揮發(fā)性化合物的相對含量。感官評定：選擇十名具有食品專業(yè)知識儲備的老師和同學(xué)為感官評定成員，根據(jù)感官評分標(biāo)準(zhǔn)表對發(fā)酵雞肉干的形態(tài)、色澤、風(fēng)味、口感（表1）進行評價，結(jié)果取平均值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理用Excel2010對數(shù)據(jù)進行分析并繪圖;用SPSS 20的ANOVA進行方差分析，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液特性及制備

2.1.1 菌種生長曲線和產(chǎn)酸特性一般來說，菌種活性最強的時期在對數(shù)生長末期到穩(wěn)定期前期[12]。由圖1可以看出，植物乳桿菌在培養(yǎng)10 h后達到對數(shù)生長期，20 h后進入穩(wěn)定生長期，從pH來看，培養(yǎng)16～18 h產(chǎn)酸速率最大，然后趨于穩(wěn)定，這與菌種生長曲線趨勢相呼應(yīng)，在菌種生長代謝旺盛時，其產(chǎn)酸速率隨之增大。由圖2可以看出，木糖葡萄球菌在培養(yǎng)10 h后達到對數(shù)生長期，28h后進入穩(wěn)定生長期，26h后產(chǎn)酸速率迅速增大，整體產(chǎn)酸要小于其他2種菌種，生產(chǎn)中可與其他菌株復(fù)合使用。由圖3可以看出，戊糖片球菌在培養(yǎng)8 h后達到對數(shù)生長期，16～18 h產(chǎn)酸速率最大，18 h后進入穩(wěn)定生長期，產(chǎn)酸量在12～24 h不斷增加，然后趨于穩(wěn)定。

可見，3種菌種的最佳收獲期為：植物乳桿菌培養(yǎng)16～18 h，木糖葡萄球菌培養(yǎng)26～28 h，戊糖片球菌培養(yǎng)16～18h，此時各菌種的活性最強且產(chǎn)酸適中。

2.1.2 菌種拮抗作用多菌種混合發(fā)酵可以豐富產(chǎn)品的風(fēng)味，從而彌補單一菌種發(fā)酵的不足[13]，但細菌在代謝過程中可能會產(chǎn)生細菌素，使與其拮抗的細菌受到抑制，無法正常生長繁殖，影響復(fù)合菌種的發(fā)酵性能，因此應(yīng)先確定各菌種是否產(chǎn)生拮抗。由表2可以看出，各菌種互相均無拮抗作用，故可以復(fù)配成發(fā)酵劑接種到雞肉中進行發(fā)酵。

2.1.3 活菌計數(shù)發(fā)酵肉的菌種接種量不得小于1x10°CFU/g，才能獲得良好的產(chǎn)品品質(zhì)14。本研究中各菌株的活菌計數(shù)結(jié)果分別為，植物乳桿菌（94+6）x108 CFU/ml;木糖葡萄球菌（32+4）x10CFU/ml;戊糖片球菌（76±6）x10 CFU/ml。計數(shù)結(jié)果滿足發(fā)酵肉菌種接種量的要求，說明試驗所用的3種菌種可用于發(fā)酵肉的生產(chǎn)。

2.2 發(fā)酵雞肉干品質(zhì)特性

2.2.1 色澤的測定由表3可以看出，同對照組相比，各發(fā)酵劑組的L*值均增大，說明添加發(fā)酵劑可以提高雞肉干的亮度，除B組外，其余各發(fā)酵組的L*值與對照組相比均呈顯著性差異（P<0.05），其中，F(xiàn)組的L*值最大為48.72，說明添加植物乳桿菌+戊糖片球菌（1：1，發(fā)酵液體積比）混合菌種有助于發(fā)酵雞肉干亮度的顯著增加。同對照組的a'*值相比，除了E組和G組顯著降低外（P<0.05），其余各發(fā)酵組的變化均不顯著（P>0.05），說明添加木糖葡萄球菌+戊糖片球菌（1：1，發(fā)酵液體積比）混合菌種、植物乳桿菌+木糖葡萄球菌+戊糖片球菌（1：1：1，發(fā)酵液體積比）混合菌種不利于發(fā)酵雞肉干紅度的增加，這可能是由于乳酸菌在生長代謝時會產(chǎn)生HO，可以分解亞鐵血紅素，使紅度降低，而只有B組的a*值高于對照組，說明添加木糖葡萄球菌單菌具有提高發(fā)酵雞肉干紅度的特性，這與夏秀芳等[15]的研究結(jié)果相同，他們研究了不同木糖葡萄球菌接種量對發(fā)酵牛肉串品質(zhì)的影響，結(jié)果表明接種木糖葡萄球菌的肉串其a*值高于未接種菌種的空白組，即木糖葡萄球菌的加入可以改善發(fā)酵肉制品的紅度。同對照組的b*值相比，D組和F組略有下降且差異不顯著（P>0.05），其余各發(fā)酵組均升高，說明這些發(fā)酵組的發(fā)酵劑具有增加發(fā)酵雞肉干黃度的能力。綜合來看，添加外源菌種有改善發(fā)酵肉制品色澤品質(zhì)的作用。

2.2.2 水分活度由圖4可以看出，各發(fā)酵劑組的水分活度值均小于對照組，說明接入發(fā)酵劑可降低雞肉干中的水分。其中A組、B組、D組與對照組差異顯著（P<0.05），說明植物乳桿菌、木糖葡萄球菌單菌及二者的復(fù)合發(fā)酵劑均可顯著降低雞肉干的水分活度（P<0.05）。常見食源性致病菌如李斯特菌和大腸桿菌等在低水分活度條件下受到顯著抑制[，因此，發(fā)酵后的雞肉干具有較高的安全性和耐貯性。

顯著低于對照組（P<0.05），其中，F(xiàn)組pH值最低（P<0.05），說明添加植物乳桿菌+戊糖片球菌（1：1，發(fā)酵液體積比）可顯著降低雞肉干的pH值，低酸環(huán)境有利于雞肉中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)發(fā)生物理、化學(xué)的分解反應(yīng)，提高產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)，產(chǎn)生多種利于人體消化吸收的氨基酸和脂肪酸，同時，低pH值還可抑制腐敗菌和致病菌的繁殖進而降低細菌毒素的產(chǎn)生[13]

2.2.3 pH 值由圖5可以看出，各處理組的pH值

2.2.4 硬度硬度指使物體變形或被穿透所需的力，是食品維持其形狀的內(nèi)部結(jié)合力[16]。由圖6可以看出，各發(fā)酵組的硬度顯著低于對照組（P<0.05），各發(fā)酵劑組間差異顯著（P<0.05），說明發(fā)酵劑的添加可顯著降低雞肉干的硬度，這是因為這3種菌種都能產(chǎn)生蛋白酶，可促使雞肉中肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的分解，破壞肉產(chǎn)品內(nèi)部的結(jié)合力，使其質(zhì)地變得柔嫩，方便咀嚼，改良了傳統(tǒng)肉干干硬的缺點。

2.2.5 揮發(fā)性物質(zhì)通過SPME-GC-MS檢測8種樣品一共分析得到118種揮發(fā)性化合物，分別為烯烴類31種、雜環(huán)化合物30種、烷烴14種、酯類13種、醇類12種、酮類7種、醛類6種、酸類3種、酚類1種、醚類1種。

由表4可以看出，對照組、A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組分別檢出32、36、34、35、35、32、3333種揮發(fā)性物質(zhì)，除E組外，其余各處理組揮發(fā)性化合物種類均高于對照組，其中，烯烴類、醇類化合物種類明顯增加，除了β-月桂烯、D-檸檬酸、庚醛、松油烯-4-醇等各組均有的化合物外，處理組還出現(xiàn)了對照組未檢出的化合物，如：芳樟醇、2，6-二甲基-4-庚酮、辛酸乙酯、辛醚等。

另外，各發(fā)酵劑組的揮發(fā)性化合物總相對含量均高于對照組，其中，除醛、酮、酚、酸類化合物有所降低外，烯烴類、醇類增加較多，說明同對照組相比，發(fā)酵劑組在經(jīng)過發(fā)酵后可以增加雞肉干的揮發(fā)性物質(zhì)，這是由于在發(fā)酵肉制品的成熟過程中，在菌體生長代謝和外界環(huán)境因素的共同作用下，肉中的蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物發(fā)生降解，脂肪分解的游離脂肪酸和蛋白質(zhì)分解的游離氨基酸可以作為風(fēng)味成分的前體物質(zhì)，經(jīng)過復(fù)雜的酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)，產(chǎn)生多種揮發(fā)性化合物，如醇、醛、酮、酯、羧酸、吡嗪及某些含硫、含鹵素的物質(zhì)等，直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味。產(chǎn)品的最終風(fēng)味品質(zhì)取決于不同揮發(fā)性化合物的種類、含量和閾值[17]。烯烴類在各發(fā)酵劑組中的相對含量最高，均高于40%，多來源于調(diào)味的香辛料，如胡椒會產(chǎn)生3-蒈烯、β-蒎烯、月桂烯等特殊的風(fēng)味，石竹烯具有辛香、藥草味道[18]，a-水芹烯具有黑胡椒和薄荷香氣[19]，發(fā)酵劑組烯烴類化合物的增加說明發(fā)酵作用可提高香辛料中的揮發(fā)性化合物，唐鑫等[20]用植物乳桿菌和酵母菌發(fā)酵辣椒汁，測定揮發(fā)性成分也發(fā)現(xiàn)烯烴類的相對含量有所增加。還原糖和氨基酸兩者間發(fā)生的美拉德反應(yīng)會產(chǎn)生雜環(huán)化合物，多具有肉類特有的香氣，檢測出吡嗪類、芳香烴類化合物的相對含量較高，這2種化合物的閾值較低，具有特殊香氣，如2，5-二甲基吡嗪具有馬鈴薯片香味[21]。閾值普遍偏高的烷烴類化合物對風(fēng)味的改良能力弱，但卻是合成某些大分子物質(zhì)的基礎(chǔ)。酯類物質(zhì)閾值偏低，被認為是發(fā)酵香腸香味的主要提供者[22]。醇類物質(zhì)中，不飽和醇對肉制品的風(fēng)味有一定貢獻，如檢出的化合物中含量較高的物質(zhì)松油烯-4-醇具有胡椒香[21]。酮類大多閾值高，對風(fēng)味的呈現(xiàn)貢獻低[23]，但部分酮類可作為中間物質(zhì)有助于形成雜環(huán)化合物，對肉味的形成仍有不可或缺的作用。醛類物質(zhì)具有甜香味和水果香[24]，對發(fā)酵肉風(fēng)味的貢獻較大，檢測出的壬醛和庚醛含量較高，有研究結(jié)果表明耗牛肉經(jīng)微波加熱后也產(chǎn)生了高含量的這2種醛類物質(zhì)，它們是熟牦牛肉的特征風(fēng)味[25]。酚類物質(zhì)閾值較低，是構(gòu)成煙熏肉制品獨特風(fēng)味的重要成分[26]。醚類、酸類的相對含量較少，對風(fēng)味的貢獻不大。

2.2.6 感官評定由圖7可以看出，同對照組相比，各處理組的感官評分值均增大，說明菌種的發(fā)酵作用可提高雞肉干的感官品質(zhì)，且C組、D組、E組、F組、G組均顯著高于對照組（P<0.05），而這5組組間的差異不顯著（P>0.05），G組的感官評分值最高為89分。表明，加入適宜適量的菌種可以提高發(fā)酵雞肉干的綜合感官品質(zhì)。

3 討論

植物乳桿菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌分別在培養(yǎng)至10h、10h、8 h時進入對數(shù)生長期，植物乳桿菌戊糖片球菌的菌種最佳收獲期均為16～18 h，產(chǎn)酸性強，木糖葡萄球菌在26～28h達到最佳收獲期，但產(chǎn)酸性差。發(fā)酵劑組雞肉干的水分活度均低于對照組，發(fā)酵劑組的pH值顯著低于對照組（P<0.05），低水分活度可以抑制腐敗菌的繁殖，同時，低pH值還可阻止致病菌的生長。發(fā)酵劑組雞肉干的色澤測定結(jié)果中，同對照組相比，L*值均增大，a*值只有2組顯著降低（P<0.05），b*值只有2組略有下降。發(fā)酵劑組的硬度較對照組顯著降低（P<0.05），揮發(fā)性化合物的種類和相對含量也有所增長：對照組、A、B、C、D、E、F、G組分別檢出32、36、3435.35.3233.33種揮發(fā)性化合物。

綜合來看，植物乳桿菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌可以作為雞肉干發(fā)酵劑來提高雞肉干的品質(zhì)，添加3種菌種混合發(fā)酵劑制得的雞肉干各項測定結(jié)果較好，且感官評分值最高，是發(fā)酵雞肉干的最佳組合。

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