祝友朋　韓長(zhǎng)志　熊智

摘要：核桃細(xì)菌性黑斑病嚴(yán)重影響著核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)，是核桃生產(chǎn)過(guò)程中危害較為嚴(yán)重的病害之一。植物病原真菌、細(xì)菌以及卵菌的分泌蛋白質(zhì)在其致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本研究以核桃細(xì)菌性黑斑病菌CFBP2528CFBP7179、CFBP8253、DW3F3.JI303、NCPPB1447、Xaj4177個(gè)菌株分泌蛋白質(zhì)氨基酸序列為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、PHD、Protscale、TargetP1.1Server、SMART等網(wǎng)站在線(xiàn)預(yù)測(cè)分析其理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、轉(zhuǎn)運(yùn)肽及保守結(jié)構(gòu)域等性質(zhì)，明確核桃細(xì)菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)所具有的特征。結(jié)果表明，在所分析的7個(gè)菌株520個(gè)分泌蛋白質(zhì)中，分泌蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)集中在6.01～7.00，蛋白質(zhì)數(shù)量所占比例為26.92%;不穩(wěn)定性系數(shù)集中在20.01～40.00，其蛋白質(zhì)數(shù)量所占比例為63.65%;親水值小于0的蛋白質(zhì)數(shù)量所占比例為76.51%，親水性最強(qiáng)的氨基酸殘基中數(shù)量最多的是D，所占比例為13.64%，疏水性最強(qiáng)的氨基酸殘基中數(shù)量最多的是L，所占比例為29.58%;分泌蛋白質(zhì)均含有無(wú)規(guī)則卷曲、a螺旋、β折疊、TM（跨膜螺旋）二級(jí)結(jié)構(gòu)，其所占比例分別為27.56%、27.17%、26.45%、1.03%;轉(zhuǎn)運(yùn)肽集中在分泌通路，其所占比例為95.38%;每個(gè)菌株平均有16個(gè)分泌蛋白質(zhì)具有保守結(jié)構(gòu)域，所占比例為21.35%。上述研究結(jié)果為深入解析核桃細(xì)菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)的功能冗余性和多樣性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：核桃細(xì)菌性黑斑病菌;分泌蛋白;理化性質(zhì);生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S664.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-4440（2019）02-0295-07

核桃作為中國(guó)第一大干果樹(shù)種，其在經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)服務(wù)國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)保障方面發(fā)揮著重要作用，目前，中國(guó)在核桃種植面積和產(chǎn)量方面均居世界第一，作為核桃的種植面積（2.87x106 hm2）、產(chǎn)量（1.15x106t）、產(chǎn)值（3.15x1010元）均居全國(guó)之首的重要省份——云南省，近些年，大力發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)[1]。云南省129個(gè)縣（市、區(qū)）中90%以上種植核桃，核桃產(chǎn)業(yè)已惠及2.6x106多名山區(qū)群眾，成為云南省覆蓋面最廣，匯集群眾最多，持續(xù)發(fā)展?jié)摿ψ畲蟮母咴厣a(chǎn)業(yè)之一。然而，近些年對(duì)中國(guó)核桃第一州（市）——云南省大理州核桃主要生產(chǎn)區(qū)開(kāi)展核桃病害調(diào)研，發(fā)現(xiàn)核桃炭疽病、核桃細(xì)菌性黑斑病等病害發(fā)生日益嚴(yán)重[2-3]。

學(xué)術(shù)界有關(guān)核桃細(xì)菌性黑斑病菌的報(bào)道尤以核桃黃單胞桿菌（Xanthomonas arboricola pv. juglandis）報(bào)道為主（46]，受該病菌侵染的核桃，果實(shí)容易腐爛、早落，出仁率和含油率均降低，核桃品質(zhì)下降并減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)落果率高達(dá)60%～80%。前期通過(guò)對(duì)X.arboricola pv. juglandis（菌株編號(hào)分別為CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417）開(kāi)展分泌蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)，以分泌蛋白質(zhì)所具有的特征（N-端含有信號(hào)肽、不含有跨膜結(jié)構(gòu)域、沒(méi)有GPI錨定位點(diǎn)、將蛋白質(zhì)分泌在胞外）為依據(jù)，利用SignalP v4.1、ProtCompB v9.0、TM-HMM v2.0、big-PI Fungal predictor TargetP v1.1等生物信息學(xué)分析程序進(jìn)行分析，明確上述7個(gè)菌株中含有的分泌蛋白質(zhì)數(shù)量分別為76個(gè)、79個(gè)、77個(gè)、78個(gè)、67個(gè)、75個(gè)、68個(gè)，平均為74個(gè)。分泌蛋白質(zhì)在植物病原菌侵染植物過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，逐漸成為植物病理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[7]，有關(guān)植物病原真菌（禾谷炭疽菌[8]、希金斯炭疽菌[9]、稻瘟菌[10]、大麗輪枝菌[1]、香蕉枯萎病菌[12]）、植物病原卵菌（樟疫霉[13]、致病疫霉[14]）、植物病原細(xì)菌（枯草芽孢桿菌BEST195[15]、結(jié)核分枝桿菌[16]、香蕉細(xì)菌性軟腐病菌[17]、茄青枯病菌以[18]及丁香假單胞桿菌番茄致病變種[19]）的分泌蛋白質(zhì)己經(jīng)明確。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)于植物病原細(xì)菌特別是經(jīng)濟(jì)林木上病原細(xì)菌分泌蛋白質(zhì)的研究尚不夠深入[7]，尚未見(jiàn)到對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及特征的分析報(bào)道[20]。

本研究基于前期的研究基礎(chǔ)，對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌中分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、不穩(wěn)定系數(shù)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)肽及保守結(jié)構(gòu)域開(kāi)展生物信息學(xué)分析，以期為核桃細(xì)菌性黑斑病的深入研究和有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 分泌蛋白質(zhì)來(lái)源

核桃細(xì)菌性黑斑病菌的全蛋白質(zhì)組序列來(lái)源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Xanthom-onas+arboricola+pv.+juglandis）。對(duì)X.arboricolapv.juglandis（菌株編號(hào)分別為CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417）開(kāi)展分泌蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)，獲得7個(gè)菌株的520個(gè)分泌蛋白質(zhì)氨基酸序列。

1.2 分泌蛋白質(zhì)性質(zhì)分析

運(yùn)用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//web.expasy.org/protparam/）分析分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，包括理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性系數(shù)、總平均親水性等，采用PHD（htp：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）分析分泌蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析分泌蛋白質(zhì)的疏水性，采用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析分泌蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，采用SMART（http：//smart.embl-heidel-berg.de/）分析分泌蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，然后對(duì)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行整理歸納。

2 結(jié)果

2.1 分泌蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)

通過(guò)對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj4177個(gè)菌株的520個(gè)分泌蛋白質(zhì)所具有的理論等電點(diǎn)數(shù)值進(jìn)行分析，CFBP2528菌株的分泌蛋白質(zhì)WP_039528270.1（ID號(hào)）具有最低理論等電點(diǎn)，為4.14;CFBP7179菌株的分泌蛋白質(zhì)WP_047130622.1（ID號(hào)）具有最高理論等電點(diǎn)，為11.71。將上述分泌蛋白質(zhì)，以理論等電點(diǎn)1.00為1個(gè)間隔單位，對(duì)其進(jìn)行歸類(lèi)分析，結(jié)果表明，核桃細(xì)菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)主要集中于6.01～7.00，其數(shù)量為140個(gè)，所占比例為26.92%;理論點(diǎn)為5.01～6.00的分泌蛋白質(zhì)有16個(gè)，所占比例為22.12%。同時(shí)，對(duì)屬于酸性蛋白質(zhì)（理論等電點(diǎn)小于6.01）的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，其數(shù)量平均為21個(gè)，所占比例為28.46%;對(duì)屬于中性蛋白（理論等電點(diǎn)位于6.01～8.00）的分泌蛋白進(jìn)行分析，其數(shù)量平均為26個(gè)，所占比例為35.00%;對(duì)屬于堿性蛋白質(zhì)（理論等電點(diǎn)大于8.00）的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，其數(shù)量平均為27個(gè)，所占比例為36.54%（圖1）。上述結(jié)果表明核桃細(xì)菌性黑斑病菌7個(gè)菌株的分泌蛋白質(zhì)中酸性蛋白質(zhì)、中性蛋白質(zhì).堿性蛋白質(zhì)數(shù)量分布較為均勻，所占比例為1.00：1.23：1.28。

2.2 分泌蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性系數(shù)

對(duì)520個(gè)分泌蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，分泌蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性系數(shù)集中在20.01～40.00（所占比例為63.65%）。同時(shí)，不穩(wěn)定性系數(shù)小于40.01（穩(wěn)定蛋白質(zhì)）的分泌蛋白質(zhì)有51個(gè)，所占比例為68.65%;不穩(wěn)定性系數(shù)大于40.01（不穩(wěn)定蛋白質(zhì)）的分泌蛋白質(zhì)有23個(gè)，所占比例為31.35%（圖2）。上述結(jié)果表明，核桃細(xì)菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)多屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 分泌蛋白質(zhì)的親水性

對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)的親水性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，分泌蛋白質(zhì)多數(shù)屬于親水性蛋白（親水性值小于0），其數(shù)量有57個(gè)，所占比例為76.54%;同時(shí)，疏水性蛋白質(zhì)（親水性值大于0）數(shù)量有17個(gè)，所占比例為23.46%（圖3）。上述結(jié)果表明，核桃細(xì)菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)多數(shù)屬于親水性蛋白質(zhì)。

此外，對(duì)分泌蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，分泌蛋白質(zhì)中親水性蛋白質(zhì)有56個(gè)，所占比例為75.96%，疏水性蛋白質(zhì)有18個(gè)，所占比例為24.04%。對(duì)分泌蛋白質(zhì)親水性最強(qiáng)氨基酸殘基、疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基種類(lèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，明確前者有17種氨基酸殘基，缺少F（苯丙氨酸）、I（異亮氨酸）、W（色氨酸）3種氨基酸殘基，存在較多的是D（天冬氨酸）、R（精氨酸）、G（甘氨酸）3種氨基酸殘基，所占比例分別為13.64%、9.44%.9.27%（圖4）;后者有13種氨基酸殘基，缺少E（谷氨酸）、H（組氨酸）、K（賴(lài)氨酸）、N（天冬酰胺）、Q（谷氨酰胺）、R、W、Y（酪氨酸）等氨基酸殘基，存在較多的是L（亮氨酸）、A（丙氨酸）、V（纈氨酸）3種氨基酸殘基，所占比例分別為29.58%、26.92%、11.27%（圖4）。

2.4 分泌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成特征

對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，分泌蛋白質(zhì)均含有無(wú)規(guī)則卷曲、a螺旋β折疊、TM（跨膜螺旋）等結(jié)構(gòu)，平均所占比例分別為27.56%、27.17%、26.45%、1.03%，即比例為1.000：0.986：0.960：0.037。同時(shí)，對(duì)分泌蛋白質(zhì)中的酸性蛋白質(zhì)、中性蛋白質(zhì)及堿性蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，就無(wú)規(guī)則卷曲、a螺旋β折疊、TM（跨膜螺旋）等結(jié)構(gòu)組成比例而言，在酸性蛋白質(zhì)中所占比例分別為27.70%、27.09%、28.05%、0.92%;在中性蛋白質(zhì)中所占比例分別為24.35%、27.32%、24.99%、1.05%;在堿性蛋白質(zhì)中所占比例分別為30.54%、27.08%、26.59%、1.09%（圖5）。因此，核桃細(xì)菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)的酸性蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成尤以β折疊為主、以跨膜螺旋結(jié)構(gòu)較少為特征，中性蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成則以跨膜螺旋結(jié)構(gòu)較少為特征，堿性蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成則以無(wú)規(guī)則卷曲較多為特征。

2.5 分泌蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽

對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)分析，明確分泌蛋白質(zhì)的線(xiàn)粒體靶向肽預(yù)測(cè)值、信號(hào)肽預(yù)測(cè)值、定位情況和預(yù)測(cè)可靠性。其中轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位分布（圖6）中，平均有71個(gè)定位在分泌通道、3個(gè)定位在線(xiàn)粒體，所占比例分別為95.38%、4.23%，CFBP2528和Xaj417還含有1個(gè)其他位置，占比為0.38%;同時(shí)，就預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性而言，平均有58個(gè)分泌蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)可靠性大于0.600，所占比例為78.46%，有4個(gè)分泌蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)可靠性小于0.200，所占比例為5.19%。

2.6 分泌蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域

通過(guò)對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌的520個(gè)分泌蛋白質(zhì)開(kāi)展保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)及分析，發(fā)現(xiàn)有111個(gè)分泌蛋白質(zhì)存在明顯的保守結(jié)構(gòu)域，即每個(gè)菌株平均有16個(gè)分泌蛋白質(zhì)具有明顯的保守結(jié)構(gòu)域（圖7），所占比例為21.35%。不同菌株分泌蛋白質(zhì)所存在的保守結(jié)構(gòu)域種類(lèi)和數(shù)量不盡相同，主要涉及的種類(lèi)有24種，最少的類(lèi)別涉及數(shù)量?jī)H為1個(gè)，最多的類(lèi)別涉及的數(shù)量為14個(gè)。

3 討論

本研究基于前期的研究基礎(chǔ)，明確核桃細(xì)菌性黑斑病菌CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3J303、NCPPB1447、Xaj417等7個(gè)菌株的分泌蛋白質(zhì)所具有的理化性質(zhì)及特征，酸性蛋白質(zhì)、中性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)數(shù)量分布較為均勻，數(shù)量所占比例為1.00：1.23：1.28;尤以穩(wěn)定蛋白質(zhì)、親水性蛋白質(zhì)居多;親水性最強(qiáng)的氨基酸殘基數(shù)量較多的是D、G、R3種氨基酸殘基，疏水性最強(qiáng)的氨基酸殘基數(shù)量較多的是L、A、V3種氨基酸殘基;均存在無(wú)規(guī)則卷曲、a螺旋β折疊、跨膜螺旋等二級(jí)結(jié)構(gòu)，所占比例為1.000：0.986：0.959：0.037;擁有明顯保守結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白質(zhì)所占比例較低。

近些年，學(xué)術(shù)界對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌的報(bào)道涉及樹(shù)生黃單胞菌胡桃變種（Xanthomonas campestrispv. juglandis）[21-22]、成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）以及上述細(xì)菌的復(fù)合[23]等，本研究?jī)H對(duì)X. ar-boricola pv. juglandi的分泌蛋白質(zhì)開(kāi)展了生物信息學(xué)分析，上述其他致病菌的分泌蛋白質(zhì)及其理化性質(zhì)情況如何，尚需進(jìn)一步明確。同時(shí)，本研究采用對(duì)比分析和平均值的方法對(duì)X. arboricola pv. juglandi的7個(gè)菌株的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，初步明確了核桃細(xì)菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其特征。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)植物病原菌（真菌、細(xì)菌、卵菌等）分泌蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)報(bào)道大多集中在某一個(gè)菌株開(kāi)展[8-20]，本研究對(duì)同一種病原菌的幾個(gè)菌株分泌蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)尚屬首次，具有一定的創(chuàng)新性，但采用不同菌株分泌蛋白質(zhì)特征值的平均數(shù)來(lái)衡量其理化性質(zhì)，其準(zhǔn)確性有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，本研究明確了7個(gè)X. arboricola pv. juglandi菌株的分泌蛋白質(zhì)數(shù)量平均為74個(gè)，以堿性蛋白質(zhì)、穩(wěn)定蛋白質(zhì)、親水性蛋白質(zhì)居多，二級(jí)結(jié)構(gòu)中跨膜螺旋較少，保守結(jié)構(gòu)域的種類(lèi)和數(shù)量較少。就單個(gè)菌株的分泌蛋白質(zhì)所具有的特征而言，親水性蛋白質(zhì)的比例為70.59%～83.12%，酸性蛋白質(zhì)的比例為25.00%～31.65%，中性蛋白質(zhì)的比例為32.89%～36.76%，堿性蛋白質(zhì)的比例為33.77%～42.11%，二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則螺旋的比例為26.23%～30.06%，a螺旋的比例為25.81%～29.49%，β折疊的比例為25.14%～28.18%，TM的比例分布為0.85%～1.28%，轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位在分泌通路的比例為92.21%～97.37%，定位在線(xiàn)粒體的比例為1.32%～7.79%，保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量為13～18個(gè)。推測(cè)上述不同菌株之間分泌蛋白質(zhì)理化性質(zhì)特征差異的原因與菌株的生存環(huán)境、培養(yǎng)因素等有關(guān)。

通過(guò)對(duì)X.arboricolapv.juglandi的分泌蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行分析，明確親水性蛋白和疏水性蛋白質(zhì)平均有56個(gè)和18個(gè)，然而，通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)分析理化性質(zhì)，明確親水性蛋白質(zhì)和疏水性蛋白質(zhì)平均有57個(gè)和17個(gè)，上述2種不同的預(yù)測(cè)方法導(dǎo)致了不同的結(jié)果。具體而言，在上述2種預(yù)測(cè)方法中，有19個(gè)分泌蛋白質(zhì)的疏水性結(jié)果存在差異性，分別為CFBP2528菌株（WP_016901454.1）、CFBP7179菌株（WP_016901454.1、WP_016902921.1、WP_026064112.1）、CFBP8253菌株（WP016901454.1、WP_016902921.1、WP_026064112.1、WP_053045589.1）、DW3F3菌株（PMR89132.1、PMR89352.1、PMR89417.1）、J303菌株（0AH79955.1、0AH79250.1、0AH76971.1）、NCPPB1447菌株（WP_016901454.1、WP_016902921.1、WP026064112.1、WP_026064348.1）、Xaj417菌株（AKU51471.1），進(jìn)一步對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)2種方法所預(yù)測(cè)的值相差最小為0.183，相差最大為12.992，造成上述差異的原因有待進(jìn)一步明確。

同時(shí)，對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)所具有的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，具有明顯保守結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白質(zhì)所占比例僅為21.35%，推測(cè)上述具有不同結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白質(zhì)在實(shí)現(xiàn)核桃細(xì)菌性黑斑病菌侵染核桃后所具有的功能具有多樣性特點(diǎn)。

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