劉悅 賈曼 崔婧 甘敏 陳剛

摘 要：為研究色氨酸在細(xì)胞水平上代謝成為吲哚乙酸、吲哚甲醛及FICZ的轉(zhuǎn)化率，本文建立了用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法同時檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的方法，采用C18色譜柱、5mmol乙酸銨水及100%乙腈為流動相進(jìn)行分離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）負(fù)離子模式對3種物質(zhì)進(jìn)行檢測，外標(biāo)法進(jìn)行定量。同時采用空白基質(zhì)加標(biāo)實驗對方法的回收率及精密度進(jìn)行了測量。方法線性較好，線性范圍廣，相關(guān)系數(shù)均為0.999，回收率在85%～102%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.75%～8.75%之間。吲哚甲醛檢出限及定量限分別為0.5、1.5ng/mL;吲哚乙酸檢出限及定量限分別為5、10.0ng/mL;FICZ的檢出限及定量限分別為0.3、1ng/mL。該方法為研究色氨酸代謝打下基礎(chǔ)，同時也為評價高色氨酸飲食的營養(yǎng)價值提供新的思路。

關(guān)鍵詞：吲哚甲醛;吲哚乙酸;FICZ;定量檢測

色氨酸參與人體各項生理過程，調(diào)節(jié)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)及免疫功能[1-5]。色氨酸屬于必須氨基酸，維持機(jī)體正常生理功能所需的色氨酸必須依靠飲食獲得[6]，色氨酸的含量是評價蛋白質(zhì)品質(zhì)的指標(biāo)之一[7]。

目前，色氨酸的生理功能主要集中在對其犬尿氨酸及血清素代謝通路的研究，對吲哚丙酮酸通路的關(guān)注度很低，但作為吲哚丙酮酸途徑的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ對人體健康至關(guān)重要。一方面，攝入的色氨酸可被腸道中的微生物代謝產(chǎn)生吲哚乙酸及吲哚甲醛，調(diào)節(jié)人體細(xì)胞色素酶系統(tǒng)[8-9]，維持腸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。吲哚甲醛還具有一定的抗菌活性。同時，尿液中吲哚乙酸含量的升高也被視為苯丙酮尿癥的癥狀之一[10]。色氨酸的光解產(chǎn)物6-甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑（FICZ）能夠誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)免疫系統(tǒng)活化[11]。另一方面，吲哚乙酸也是最早被發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性植物生長激素，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用于果蔬催熟及改良品質(zhì)等方面[12-13]，在植物各個器官中均有分布[12]。吲哚乙酸在可食用農(nóng)產(chǎn)品，尤其是植物性農(nóng)產(chǎn)品中的含量也與人體健康密切相關(guān)。

色氨酸存在于大多數(shù)可食用蛋白質(zhì)中，且?guī)缀醮嬖谟谒行问降闹参锏鞍字?，大米、雞蛋及牛奶等是色氨酸的主要食物來源。因此，有必要建立一套準(zhǔn)確、可靠的色氨酸代謝物定量方法，實現(xiàn)對人體攝入色氨酸代謝通路的研究，為評價色氨酸的營養(yǎng)價值提供新的思路。目前對吲哚乙酸的檢測方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜法、離子色譜法及生物傳感器法，目標(biāo)基質(zhì)大多為水果、蔬菜等植物類[16-19];對吲哚甲醛的檢測目前報道較少，主要是液質(zhì)聯(lián)用法;FICZ也普遍采用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測[14-15，20]。為了研究色氨酸被細(xì)胞代謝為吲哚乙酸、吲哚甲醛及FICZ的轉(zhuǎn)化率，建立了利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的方法，靈敏度高、線性范圍廣、方法簡單，為研究色氨酸的體內(nèi)外代謝提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（Agilent QQQ 6470，安捷倫公司）、離心機(jī)（Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge，Thermo Fisher公司），渦旋混合儀（GENIUS 3，德國IKA公司）、電子天平（AG245，瑞士Metler Toledo公司）、0.22μm濾膜、菲洛門C18色譜柱（粒徑2.6μm，內(nèi)徑4.6 mmol，長度100 mmol）。

1.1.2 試劑 吲哚甲醛標(biāo)準(zhǔn)品（99%，Sigma）、吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（99%，Sigma）、FICZ標(biāo)準(zhǔn)品（99%，Sigma）、甲醇（色譜純，Thermo公司）、乙腈（色譜純，Thermo公司）、純凈水（娃哈哈）、DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）、胎牛血清（Invitrogen公司）、乙酸銨（≥98%，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 吲哚甲醛和吲哚乙酸用甲醇配制成濃度為1mg/mL的母液，置于-20℃冰箱中保存。FICZ標(biāo)準(zhǔn)品用DMSO溶液配制成濃度為1mg/mL的母液，置于-20℃冰箱中保存。分別取吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ母液適量，用乙腈逐級稀釋為工作液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為菲洛門C18色譜柱（粒徑2.6μm、內(nèi)徑4.6mmol、長度100 mmol），流動相A為5mmol/L乙酸銨水，流動相B為乙腈;進(jìn)樣量5μL，流速0.4mL/min，柱溫為35℃，后運行時間為2min（表1）。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源負(fù)離子掃描（ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），鞘氣溫度250℃，鞘氣流速11L/min，干燥氣溫度300℃，干燥氣流速5L/min，毛細(xì)管電壓-3 500V，霧化器壓力45psi，噴嘴電壓-500V（表2）。

2.2 檢出限及定量限

本方法以信噪比（S/N）≥3的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢出限（LOD），以信噪比（S/N）≥10的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為定量限（LOQ）。FICZ的檢出限和定量限最低，分別為0.3、1ng/mL。其次為吲哚甲醛，檢出限和定量限分別為0.5、1.5ng/mL。吲哚乙酸的檢出限和定量限分別為5、10ng/mL，為3種化合物之最高檢出限和定量限濃度（表4）。

2.3 方法準(zhǔn)確度及精密度

分別在空白培養(yǎng)基中添加高、中、低3種不同濃度的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ溶液，使培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)品終濃度分別為10、100、500ng/mL，每個濃度設(shè)5個平行，重復(fù)3次。將空白培養(yǎng)基及加標(biāo)培養(yǎng)基按前述前處理方法處理之后上機(jī)檢測?；厥章试?5%～102%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.75%～8.75%之間（表5）。

2.4 樣品測定

收集用普通商業(yè)DMEM培養(yǎng)基、外源添加2mmol或5mmol色氨酸的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h或48 h 后的293T細(xì)胞上清，對培養(yǎng)上清中的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ進(jìn)行檢測，從而判定人體細(xì)胞體外代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的水平。實驗重復(fù)3次，每組2個平行。由Graphpad軟件完成方差分析，P>0.05時為差異性顯著，定量限以下視為未檢出。由表6可以看出，293T代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚甲醛及吲哚乙酸的水平與外源色氨酸濃度及培養(yǎng)時間呈正相關(guān)，F(xiàn)ICZ在各組含量沒有顯著差異或未檢出。結(jié)果表明，色氨酸能被293T細(xì)胞在體外代謝為吲哚甲醛、吲哚乙酸，為進(jìn)一步研究色氨酸的體內(nèi)吲哚丙酮酸代謝通路提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論

本方法樣品前處理程序簡單，操作便捷?？紤]到細(xì)胞培養(yǎng)基成分相對單一，干擾雜質(zhì)較少，因此前處理采用離心后過濾的方式去除大分子蛋白或其他雜質(zhì)。本方法采用C18色譜柱分離，流動相5mmol乙酸銨水、100%乙腈實現(xiàn)了化合物的分離，峰型好、響應(yīng)高。本方法的靈敏度高、線性范圍廣、回收率高且重現(xiàn)性好，為細(xì)胞代謝色氨酸產(chǎn)生的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ定量研究打下基礎(chǔ)?！?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]Ploder M，Spitter A，Kurz K，et al.Accelerated tryptophan degradation predicts poor survival in trauma and sepsis patients[J].International Journal of Tryptophan Research，2010，3（3）：61-67.

[2]Michalowska M，Znorko B，Kaminski T，et al.New insights into tryptophan and its metabolites in the regulation of bone metabolism[J].Journal of Physiology & Pharmacology An Official Journal of the Polish Physiological Society，2015，66（6）：779-784.

[3]Mardones O，Devia E，Labbe B S，et al.Effect of L-tryptophan and melatonin supplementation on the serotonin gastrointestinal content and digestive enzymatic activity for Salmo salar and Oncorhynchus kisutch[J].Aquaculture，2018，1（1）：482-485.

[4]Fukuwatari T，Shibata K.Nutritional aspect of tryptophan metabolism[J].International Journal of Tryptophan Research，2013，6（Suppl 1）：3-8.

[5]朱正偉，王再興，張學(xué)軍.煙酸缺乏癥的研究進(jìn)展[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2014，30（1）：27-29.

[6]王仁華，劉曉蘭，喻兵權(quán)，等.色氨酸的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].湖南飼料，2013（1）：23-24.

[7]Landry J，Delhaye S. The tryptophan content of pearl millet grai-ns as a function of nitrogen content[J].Phytochemistry，1995，38（1）：5-8.

[8]Cheng Y，Jin UH，Allred C D，et al.Aryl hydrocarbon receptor activity of tryptophan metabolites in young adult mouse colonocytes[J].Drug Metabolism & Disposition the Biological Fate of Chemicals，2015，43（10）：1536.

[9]Zelante T，Iannitti R G，Cunha C，et al.Tryptophan catabolites from microbiota engage aryl hydrocarbon receptor and balance mucosal reactivity via interleukin-22[J].Immolunity，2013，39（2）：372-385.

[10]Weissbach H，King W，Sjoerdsma A，et al.Formation of indole-3-acetic acid and tryptamine in animals：a method for estimation of indole-3-acetic acid in tissues[J].Journal of Biological Chemistry，1959，234（1）：81.

[11]Berdeaux A，Boissier J R，Giudicelli J F.Control of Treg and Th17 cell differentiation by the aryl hydrocarbon receptor（AHR）[J].Chinese Journal of Allergy & Clinical Immolunology，2008，58（3）：287-294.

[12]趙曉菊，胡敏，梁彥濤，等.吲哚乙酸生物合成及其結(jié)合物水解的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30（6）：254-259.

[13]杜麗清，姚艷麗，孫光明，等.不同濃度IAA色氨酸處理對菠蘿果實品質(zhì)發(fā)育的影響[J].熱帶作物學(xué)報，2014，35（3）：433-437.

[14]Smirnova A，Wincent E，Vikstrom BL，et al.Evidence for new light-independent pathways for generation of the endogenous aryl hydrocarbon receptor agonist FICZ [J].Chemical Research in Toxicology，2016，29（1）：75-86.

[15]Wincent E，Amini N，Luecke S，et al.The suggested physiologic aryl hydrocarbon receptor activator and cytochrome P4501 substrate 6-formylindolo[3，2-b]carbazole is present in humans [J].The Journal of Biological Chemistry，2009，284（5）：2690-2696.

[16]劉富發(fā).多種芳香代謝物的UHPLC-MS/MS與NMR分析研究[D].武昌：中國科學(xué)院研究生院（武漢物理與數(shù)學(xué)研究所），2016.

[17]趙振東，李平，朱建忠.離子色譜法測定水果和蔬菜中3-吲哚乙酸和3-吲哚丁酸的含量 [J].理化檢驗-化學(xué)分冊，2017，53（5）：590-593.

[18]陳亞玲，江陽，李永新，等.高效液相色譜法同時測定瓜果中6種植物生長調(diào)節(jié)劑[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，43（5）：891-895.

[19]高文慧，王兆群，泮俊青，等.基于金屬納米粒子增敏的SPR生物傳感器檢測吲哚乙酸 [J].影像科學(xué)與光化學(xué)，2017，35（6）：843-852.

[20]楊子秋.高效液相色譜法檢測果蔬汁中五種添加劑[J].中國食物與營養(yǎng)，2018，24（2）：40-42.

[21]周黎，余以剛，徐紅，等.免疫親和柱—超高效液相色譜法測定維生素飲料中維生素B12[J].中國食物與營養(yǎng)，2018，24（3）：27-29.

[22]Wincnet E，Bengtsson J，Mohammoladi BA，et al. Inhibition of cytochrome P4501-dependent clearance of the endogenous agonist FICZ as a mechanism for activation of the aryl hydrocarbon receptor [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（12）：4479-4484.