陳智賢， 梁基韻， 劉興麗， 羅美華， 周成宇， 于新發(fā)

南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院(佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院)腫瘤科(廣東佛山 528300)

原發(fā)性肝癌位列世界癌癥死因順序第2位，每年近3/4的新發(fā)病例在發(fā)展中國(guó)家，我國(guó)肝癌的發(fā)病與死亡數(shù)超過(guò)全球的一半，其病死率高達(dá)95%[1]。早期肝癌可以沒(méi)有任何癥狀，當(dāng)患者身體不適就診時(shí)，絕大多數(shù)已經(jīng)發(fā)展為中晚期，無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除，只能接受如經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、靶向治療或免疫治療等的治療方式[2-3]。如何預(yù)測(cè)患者對(duì)各種治療的反應(yīng)是肝癌研究的一個(gè)重要方向。原發(fā)性肝癌中85%～90%是肝細(xì)胞性肝癌。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是目前反映肝細(xì)胞癌患者預(yù)后和治療效果的主要腫瘤標(biāo)志物。雖然血液中高AFP濃度(本文將質(zhì)量濃度簡(jiǎn)稱為濃度，下同)總體上意味著預(yù)后不良，但是沒(méi)有明確的閾值來(lái)幫助臨床決策[4-5]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示，婆羅雙樹(shù)樣蛋白4(sal-like protein 4，SALL4)在肝細(xì)胞癌中特異性高表達(dá)，在癌旁或肝硬化的部位不表達(dá)或低表達(dá)，如果肝細(xì)胞癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中SALL4呈明顯的高表達(dá)狀態(tài)，則患者預(yù)后明顯較差[6-8]。但SALL4對(duì)不能手術(shù)患者的生存及治療是否有指導(dǎo)作用鮮有研究。根據(jù)我國(guó)肝癌臨床診療規(guī)范，大部分患者可以根據(jù)臨床證據(jù)進(jìn)行確診，而不必進(jìn)行活檢。在無(wú)需活檢的情況下，如果外周血中SALL4的濃度可以很好地反映患者的預(yù)后，則非常有利于臨床決策。外周血中SALL4的濃度與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后之間的關(guān)系如何，我們進(jìn)行了初步的研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院2017年1月1日至12月31日收治的診斷為肝細(xì)胞癌患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)(符合以下任意一項(xiàng))：符合我國(guó)肝癌診療規(guī)范2017版(以下簡(jiǎn)稱診療規(guī)范)中肝細(xì)胞癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；組織病理診斷為肝細(xì)胞性肝癌；術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞性肝癌且增強(qiáng)CT或MRI提示復(fù)發(fā)者。排除標(biāo)準(zhǔn)(符合以下任意一項(xiàng))：入組后接受了以根治為目的的治療，如手術(shù)、微波或射頻消融治療；不滿足臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)且無(wú)病理診斷；入院時(shí)呈昏迷狀態(tài)；入組后3個(gè)月內(nèi)失隨訪。

按納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，研究共納入患者66例，其中男60例，女6例，年齡31～86歲，平均(58.17±12.30)歲。初治患者30例，既往接受過(guò)非手術(shù)治療患者30例，術(shù)后復(fù)發(fā)患者6例。符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)51例，病理診斷15例。肝硬化患者41例，無(wú)肝硬化患者25例。乙肝患者60例，丙肝患者3例，無(wú)肝炎患者3例。肝功能Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)32例，B級(jí)24例，C級(jí)10例。按診療規(guī)范分期：Ⅰa期1例，Ⅰb期7例，Ⅱa期5例，Ⅱb期22例，Ⅲa期10例，Ⅲb期8例，Ⅳ期13例。按巴塞羅那分期(barcelona clinic liver cancer，BCLC)，A期6例，B期7例，C期40例，D期13例。中位隨訪時(shí)間102 d，出院3個(gè)月至1年內(nèi)失隨訪患者4例，隨訪超過(guò)1年仍存活者9例，隨訪至死亡者53例。

患者按入組后不同的治療方式分為兩組。入組后未進(jìn)行任何抗腫瘤治療的患者為無(wú)治療組，共42例，其中10例肝功能Child-Pugh為C級(jí)，不適合進(jìn)行抗腫瘤治療，余下32例患者拒絕TACE或全身治療。入組后接受TACE聯(lián)合或不聯(lián)合姑息性消融治療，或者使用索拉非尼的患者為有治療組，共24例，其中僅接受TACE治療者16例，TACE聯(lián)合姑息性消融者4例，使用索拉非尼者4例。

本研究的觀察指標(biāo)是患者的總體生存期(overall survival，OS)，其定義為入組日期至死亡或末次隨訪日期。

1.2 方法

1.2.1 SALL4標(biāo)本采集及處理 使用不含任何添加劑的真空采血管，抽取患者入組當(dāng)天早晨空腹全血5 mL，靜置1 h后，3 000 r/min，離心3 min，取上層血清分裝至EP管，置入-80℃冰箱保存。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)血清SALL4濃度 從-80℃冰箱中取出待檢測(cè)的血清樣品，室溫下完全溶解。按試劑盒(人SALL4 ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)，將50×的洗滌液在室溫震蕩混勻，用去離子水稀釋至1×。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品50 μL加入96孔板，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔；每份血清樣品3個(gè)復(fù)孔，每孔加40 μL樣品稀釋液和10 μL血清樣品。除空白孔外，所有孔加入酶標(biāo)試劑100 μL。用封板膜封板后置于37℃溫育60 min。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀(muLTISKAN FC，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)讀取450 nm下的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算每個(gè)樣品孔的濃度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算每份血清樣品中SALL4的實(shí)際濃度。

1.2.3 AFP的檢測(cè) 使用含分離膠促凝劑的真空采血管，與SALL4血液標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行采集，采集后使用雅培ARCHITIECT全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料的正態(tài)分布檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料的比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較采用2檢驗(yàn)。將年齡、肝硬化、乙肝、肝功能Child-Pugh分級(jí)、診療規(guī)范分期、AFP濃度、SALL4濃度等因素納入Cox回歸分析。生存曲線圖的繪制采用Kaplan-Meier方法，不同類型患者生存時(shí)間之間差異的比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者生存時(shí)間的Cox回歸分析 若SALL4濃度以連續(xù)變量形式作為Cox回歸分析的因素之一。在無(wú)治療組，Cox回歸分析顯示患者的生存時(shí)間與肝功能分級(jí)有關(guān)。在有治療組，則患者的生存時(shí)間僅與AFP的濃度有關(guān)。見(jiàn)表1。

以800 ng/mL為閾值，將血清SALL4濃度≥800 ng/mL定義為高濃度，反之為低濃度。以二分類變量形式再進(jìn)行Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)：在無(wú)治療組，與上述結(jié)果一致，即患者的生存時(shí)間與肝功能分級(jí)有關(guān)；但在有治療組，分析則顯示AFP、肝功能分級(jí)、SALL4濃度的高低與患者生存時(shí)間有關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 Cox回歸分析

2.2 無(wú)治療組患者Kaplan-Meier生存分析 無(wú)治療組，肝功能A級(jí)患者中位OS為162 d(95%CI：10.512～313.488)。B級(jí)患者中位OS為68 d(95%CI：50.937～85.063)，C級(jí)患者中位OS為16 d(95%CI：0.505～31.495)，肝功能分級(jí)不同患者的生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在無(wú)治療組患者中，SALL4高濃度患者23例，中位OS為59 d(95%CI：12.045～105.955)，SALL4低濃度患者19例，中位OS為69 d(95%CI：13.545～124.455)，兩者生存時(shí)間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.798)。見(jiàn)圖1。

圖1 無(wú)治療組不同SALL4濃度患者的生存曲線

2.3 有治療組患者Kaplan-Meier生存分析 有治療組，不同肝功能分級(jí)的患者，生存時(shí)間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.139)。若以不同的AFP濃度作為閾值，以這些閾值對(duì)有治療組患者進(jìn)行分層，生存時(shí)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SALL4則以800 ng/mL作為閾值，患者生存時(shí)間的差異才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 有治療組AFP和SALL4不同閾值與生存時(shí)間的Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果

有治療組，SALL4高濃度者14例，中位OS為115 d(95%CI：0～232.338)，1年生存率為28.57%；SALL4低濃度者10例，中位OS未達(dá)到，1年生存率為50.00%，兩者生存時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。見(jiàn)圖2。SALL4高濃度患者AFP濃度為2 120.00(142.96，6 945.00)μg/L，SALL4低濃度患者AFP濃度為118.56(9.50，3 570)μg/L，AFP在兩種類型患者中均呈非正態(tài)分布(P<0.001)，非參數(shù)秩和檢驗(yàn)顯示兩種類型患者AFP濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.212)。兩種類型患者在肝功能分級(jí)、診療規(guī)范分期方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=0.007，P=1.000；2=3.179，P=0.672)。

圖2 有治療組不同SALL4濃度患者的生存曲線

3 討論

3.1 血清SALL4濃度對(duì)不同類型肝細(xì)胞癌患者的意義 SALL4是一種癌胚蛋白，SALL4基因的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致一系列與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因同時(shí)高表達(dá)[9-10]。SALL4的高表達(dá)有利于DNA修復(fù)、抵抗化療藥物、抵抗藥物誘導(dǎo)細(xì)胞正?；痆11-13]。因此SALL4高表達(dá)的癌細(xì)胞可表現(xiàn)為放化療抵抗、侵襲能力強(qiáng)和容易轉(zhuǎn)移[14-15]。

對(duì)于已行手術(shù)切除的肝癌而言，如果切除的肝癌組織高表達(dá)SALL4，則血管受侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更高，患者生存時(shí)間更短[6-7]。SALL4特異性表達(dá)于肝癌組織中，癌旁組織中明顯低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，且與患者性別、年齡、腫瘤大小、乙肝、肝硬化、肝癌病理分級(jí)、腫瘤包膜侵犯與否和門脈癌栓存在與否無(wú)顯著相關(guān)性[6， 16]。不僅肝癌患者手術(shù)切除標(biāo)本SALL4的表達(dá)狀態(tài)與預(yù)后相關(guān)，患者手術(shù)后血清SALL4的濃度也與患者的預(yù)后呈現(xiàn)類似的關(guān)系[17]。SALL4無(wú)論是在肝癌組織的高表達(dá)還是血清中的高濃度，均預(yù)示患者的預(yù)后差。

本研究的研究對(duì)象為不能或拒絕手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌患者。如果這些患者不進(jìn)行任何治療，血清SALL4濃度高的患者生存時(shí)間同樣短于低濃度者，但是兩者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.798)。決定這類患者預(yù)后的重要因素是肝功能的狀態(tài)，肝功能越好，生存時(shí)間越長(zhǎng)(P<0.001)。因此不能手術(shù)且未進(jìn)行任何抗腫瘤治療的肝細(xì)胞癌患者，血清SALL4濃度的高低不能很好地反映患者的預(yù)后。

對(duì)于有治療的患者，肝功能的差異并不影響這類患者的預(yù)后(P=0.139)。而SALL4濃度高的患者生存時(shí)間短于濃度低者，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。因此，對(duì)于不能手術(shù)但接受了如TACE、索拉非尼等治療的肝細(xì)胞癌患者，血清SALL4濃度的高低可作為治療效果的預(yù)測(cè)指標(biāo)。血清SALL4濃度低的患者對(duì)治療的反應(yīng)好，生存時(shí)間長(zhǎng)。

3.2 SALL4與AFP相比的優(yōu)勢(shì) 總體而言，AFP濃度高的肝細(xì)胞癌患者預(yù)后差，但是AFP沒(méi)有明確的閾值來(lái)預(yù)測(cè)治療的效果[4]。而且我國(guó)肝細(xì)胞癌患者常合并肝硬化，本研究中合并肝硬化的患者比例達(dá)62.12%(41/66)，肝硬化同樣可導(dǎo)致AFP升高。目前有多個(gè)系統(tǒng)用于評(píng)價(jià)肝癌患者預(yù)后、指導(dǎo)治療決策。Bruix等[18]認(rèn)為評(píng)價(jià)肝癌預(yù)后的參數(shù)主要有四大類，分別是腫瘤本身的情況、肝功能情況、全身一般狀態(tài)和治療的效果。目前肝癌的評(píng)價(jià)系統(tǒng)主要有美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)分期(american joint committee on cancer，AJCC)， BCLC分期，意大利肝癌評(píng)分(cancer of the liver italian program，CLIP)， 香港中文大學(xué)預(yù)后指數(shù)(chinese university prognostic index，CUPI)和Okuda分期等。并非所有的評(píng)價(jià)系統(tǒng)均將AFP納入評(píng)價(jià)參數(shù)之中。

本研究同樣發(fā)現(xiàn)，雖然對(duì)于有治療的患者，AFP濃度與生存時(shí)間相關(guān)(表1)，但是沒(méi)有明確的閾值來(lái)對(duì)患者進(jìn)行區(qū)分。AFP閾值的取值范圍從200～3 000 μg/mL均可達(dá)到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生存時(shí)間差異(表2)。與之相反，對(duì)于有治療的患者，SALL4的閾值取值范圍從600～1 400 ng/mL中選擇，只有800 ng/mL這個(gè)閾值對(duì)患者進(jìn)行區(qū)分，才能顯示出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生存時(shí)間(表2)。如果SALL4以連續(xù)變量形式進(jìn)行Cox多因素分析，則未發(fā)現(xiàn)與生存時(shí)間相關(guān)；但如果以800 ng/mL為閾值，采用二分類變量的形式進(jìn)行分析，則與生存時(shí)間相關(guān)(表1)。這說(shuō)明以血清SALL4濃度對(duì)患者進(jìn)行區(qū)分，具有明顯的閾值，這個(gè)合適的閾值為800 ng/mL。雖然SALL4濃度高的患者AFP濃度中位數(shù)也高，但是與SALL4低濃度患者的AFP相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.212)。

綜上所述，對(duì)于不能手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌患者，如果不進(jìn)行任何治療，血清SALL4的濃度高低并不能很好地反映患者的預(yù)后。但是對(duì)于接受TACE等局部治療或索拉非尼等全身治療的患者，以800 ng/mL為閾值，血清SALL4濃度低可作為治療效果良好、生存時(shí)間長(zhǎng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

由于病例數(shù)不多，本研究具有局限性，為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，將繼續(xù)納入更多的病例進(jìn)行隨訪、分析。