劉曉華 魏永佳 陳麗麗

鼻息肉是一種常見(jiàn)病，其發(fā)病率及復(fù)發(fā)率均較高，目前治療最有效的方法為鼻內(nèi)鏡手術(shù)加糖皮質(zhì)激素治療，但是治療后仍有20%左右復(fù)發(fā)，是鼻科目前治療的難點(diǎn)[1]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。研究證實(shí)，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，在這個(gè)過(guò)程中起著重要的作用[2]。本研究主要應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)及間接免疫熒光技術(shù)，以此來(lái)檢測(cè)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2（Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK2）在鼻息肉（nasal polyp，NP）組織中的表達(dá)位置及程度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)分析p-ERK2在鼻息肉的發(fā)生發(fā)展中的作用，觀察其與鼻息肉復(fù)發(fā)是否存在關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)本均取自2018年1月—2018年6月于黑龍江省醫(yī)院耳鼻喉科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者，下鼻甲正常鼻黏膜組織為對(duì)照組20例（男12例，女8例）患者年齡最大55歲，最小28歲，平均年齡（41.2±13.1）歲；鼻息肉組選伴有息肉的慢性鼻竇炎患者31例（男17例，女14例），患者年齡最大65歲，最小29歲，平均年齡（47.5±18.1）歲；復(fù)發(fā)性鼻息肉組患者都兩次以上鼻息肉手術(shù)史患者23例（男14例，女9例），患者年齡最大63歲，最小33歲，平均年齡（48.7±15.3）歲。三組患者均排除后鼻孔息肉、哮喘、過(guò)敏性鼻炎，均排除嚴(yán)重的其他系統(tǒng)疾病；均于術(shù)中采集標(biāo)本，術(shù)后經(jīng)病理科證實(shí)。所有患者取材前均簽訂黑龍江省醫(yī)院批準(zhǔn)的知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑來(lái)源 主要試劑及來(lái)源PVDF膜、兔抗人p-ERK2單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司（美國(guó)），SP試劑盒購(gòu)自福州邁新公司（中國(guó)）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

Westernblotting變性（100 ℃，3 min）后每泳道加樣50 mg，SDS-PAGE凝膠電泳（90 V，2 h），轉(zhuǎn)膜（90 V，1.5 h）后封閉，先后加入一抗（1 mg/mL）、二抗（1:200），水平搖床室溫孵育各1.5 h，顯色、曝光及拍照。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)

（1）冰凍切片3 μm，室溫放置30 min后，入4 ℃丙酮固定10 min，PBS洗5 min×3次。用3%過(guò)氧化氫孵育5min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS洗5 min×2次;（2）0.01 M PBS（pH 7.2 ～ 7.4）浸洗30min；（3）1% BSA-PBS封閉30 min；（4）傾去，分別加1∶30稀釋的兩支一抗，置濕盒中4 ℃過(guò)夜；（5）次日拿出濕盒，棄一抗，0.01 M PBS（pH 7.2 ～ 7.4）沖洗，3 min×3次；（6）滴加1:100稀釋的對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗（1% BSA-PBS稀釋?zhuān)?7℃孵育30 min；（7）棄二抗，0.01 MPBS（pH 7.2 ～ 7.4）；（8）DAPI進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染20 min，PBS沖洗3 min，重復(fù)3次；（9）0.5 M Na2CO3-50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并取片；（10）在激光共聚焦顯微鏡下,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（400倍），然后利用圖像分析軟件計(jì)算熒光度平均值。

1.3 觀察指標(biāo)

集齊全部的標(biāo)本懸液之后，可開(kāi)始刺激、培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞膜打孔，熒光抗體進(jìn)行染色標(biāo)記，通過(guò)Western blot及免疫熒光法檢測(cè)p-ERK2表達(dá)情況的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料采用方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WB 檢測(cè) p-ERK2 的表達(dá)結(jié)果

Western blotting p-ERK2在正常鼻黏膜組織和鼻息肉組及復(fù)發(fā)性鼻息肉組的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

2.2 熒光強(qiáng)度值p-ERK2的表達(dá)結(jié)果

熒光強(qiáng)度值p-ERK2在正常鼻黏膜組織和鼻息肉組及復(fù)發(fā)性鼻息肉組的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表2。

3 討論

現(xiàn)有研究表明，多種炎癥因子的表達(dá)和嗜酸性粒細(xì)胞的作用是鼻息肉發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，目前發(fā)現(xiàn)的參與鼻息肉病理過(guò)程的化學(xué)介質(zhì)多達(dá)數(shù)十種甚至上百種，其中的細(xì)胞因子倍受重視[3]。細(xì)胞因子是由機(jī)體的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成和分泌，其具有較強(qiáng)的生物活性，并且廣泛的存在于鼻息肉的微環(huán)境中。哺乳類(lèi)細(xì)胞目前發(fā)現(xiàn)存在著下述三條MAPK信號(hào)通路，ERK信號(hào)通路是最經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，ERK 1/2 是ERK信號(hào)通路的重要下游元件，并且研究發(fā)現(xiàn)ERK2是在呼吸道黏膜的主要亞型。ERK2據(jù)目前所知有2種形式，激活型及失活型，當(dāng)被激活時(shí)，p-ERK2會(huì)進(jìn)入胞核引起一系列的細(xì)胞反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：正常鼻黏膜組中p-ERK2主要表達(dá)在腺上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核。鼻息肉組和復(fù)發(fā)性鼻息肉組：p-ERK2主要表達(dá)在增生的上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核。三組結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），結(jié)合其他學(xué)者的研究，可推斷p-ERK2的主要作用機(jī)制如下：（1）ERK 信號(hào)通路的激活促進(jìn)了黏膜內(nèi)淋巴細(xì)胞的大量增殖、分化及遷移；（2）ERK 信號(hào)通路激活 IL-5 和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子受體進(jìn)而激活嗜酸性粒細(xì)胞促使其脫顆粒；（3）ERK信號(hào)通路通過(guò)誘導(dǎo)Ig-E 抗體的產(chǎn)生，致氣道發(fā)生變應(yīng)性炎癥；（4）ERK 信號(hào)通路促使T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞等Ig-E 介導(dǎo)的趨化因子、半胱氨酸白三烯及細(xì)胞因子釋放；（5）ERK信號(hào)通路持續(xù)激活發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，導(dǎo)致呼吸道上皮細(xì)胞正常的新陳代謝打亂，導(dǎo)致屏障功能下降[4-7]。ERK2調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡，p-ERK2 表達(dá)升高可能會(huì)產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡的作用[8-12]，可能導(dǎo)致使鼻黏膜上皮細(xì)胞過(guò)度增殖，逐漸形成息肉樣增生。p-ERK2還表達(dá)在鼻息肉的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，可以推測(cè)ERK 信號(hào)通路的激活與鼻息肉的發(fā)展相關(guān)。鼻息肉組織中，p-ERK2表達(dá)量明顯升高，在復(fù)發(fā)性鼻息中， p-ERK2表達(dá)進(jìn)一步升高，在息肉組織增生的上皮細(xì)胞、黏膜下炎癥細(xì)胞以及腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，其在復(fù)發(fā)性鼻息肉組中表達(dá)更加明顯。本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法檢測(cè)，因?yàn)槊庖呓M化只能顯示目的蛋白的定位， Western-blot檢測(cè)可以測(cè)定目的蛋白的分子量。在定位和分子量都正確的情況下，整個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性會(huì)更高一點(diǎn)，不容易受假陽(yáng)性的干擾。

表1 WB 檢測(cè)p-ERK2 在正常鼻黏膜、鼻息肉、復(fù)發(fā)性鼻息肉組織的表達(dá)結(jié)果（ ，pg/mL）

表1 WB 檢測(cè)p-ERK2 在正常鼻黏膜、鼻息肉、復(fù)發(fā)性鼻息肉組織的表達(dá)結(jié)果（ ，pg/mL）

注：與正常組比較，*t=3.504，**t=3.244，P ＜0.05

分組 例數(shù) p-ERK2正常鼻黏膜組 20 0.402±0.142鼻息肉組 31 0.593±0.215*復(fù)發(fā)性鼻息肉組 23 0.621±0.271**F 值 - 6.410 P 值 - ＜0.005

表2 免疫熒光hf 檢測(cè)p-ERK2 在正常鼻黏膜、鼻息肉、復(fù)發(fā)性鼻息肉組織的表達(dá)結(jié)果

表2 免疫熒光hf 檢測(cè)p-ERK2 在正常鼻黏膜、鼻息肉、復(fù)發(fā)性鼻息肉組織的表達(dá)結(jié)果

注：與正常組比較，*t=5.170，**t=8.056，P ＜0.05

分組 例數(shù) p-ERK2正常鼻黏膜組 20 733.6±119.3鼻息肉組 31 1 017.8±129.4*復(fù)發(fā)性鼻息肉組 23 1 187.5±225.8**F 值 - 41.880 P 值 - ＜0.05

綜上所述，p-ERK2 表達(dá)量明顯升高與鼻息肉的發(fā)生與復(fù)發(fā)相關(guān)。抑制p-ERK2的激活可能為臨床工作中治療鼻息肉提供新的思路和方向。