楊喜珍，楊 利，覃 亞，劉 磊，楊 歡，謝 婉

（西藏日喀則市農業(yè)科學研究所，西藏 日喀則 857000）

光合作用可以為植物提供生長及發(fā)育所需要的各種有機物質，在植物的生長和發(fā)育過程中起著重要作用[1]。作物體內葉綠素含量的高低是直接反映其光合能力的重要指標之一，葉綠素的含量對光合速率和光合產物的形成有著直接影響，最終影響作物產量和品質的提高[2,3]。類胡蘿卜素是植物體中重要的抗氧化物質，在減輕和消除由干旱等逆境引發(fā)的活性氧傷害方面直接發(fā)揮作用，同時通過逆境激素ABA 間接在植物抗旱中發(fā)揮作用[4]。水分虧缺對光合系統(tǒng)的影響十分復雜，不僅影響葉綠素合成，也影響光合器官結構及光電子傳遞系統(tǒng)[5]。國內外學者對干旱脅迫下不同植物葉綠素和類胡蘿卜素含量的變化進行了大量研究[6-10]。

馬鈴薯是中國第四大糧食作物，對水分的虧缺非常敏感[11]，干旱是馬鈴薯生產的重要限制因素[12]，因而國內外學者在馬鈴薯抗旱育種和抗旱栽培方面進行了廣泛研究[11-13]。馬鈴薯塊莖產量形成依賴于葉片的光合作用，水分虧缺可減少功能葉面積和光合速率，縮短植株綠色體的持續(xù)期，葉綠素含量隨干旱脅迫時間的延長而降低，葉綠素熒光下降，光合作用降低，從而造成馬鈴薯減產[5]。本試驗采用不同濃度聚乙二醇（PEG-8000）模擬干旱脅迫，研究不同馬鈴薯品種（系）組培苗葉綠素和類胡蘿卜素含量的變化，旨在闡明馬鈴薯組培苗不同強度干旱脅迫下幼苗光合色素的變化特點，為馬鈴薯抗旱機制的研究及抗旱品種篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年8～12月在西藏自治區(qū)馬鈴薯工程研究中心完成。

供試馬鈴薯品種（系）為‘渭薯1號’、‘東農303’、‘青薯9號’、‘春薯2號’、‘D613’、‘200902’共6個品種（系）的脫毒組培苗。其中‘D613’為中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供的彩色馬鈴薯高代品系，‘200902’為西藏自治區(qū)薯類脫毒中心提供的系統(tǒng)選育品系?！嗍?號’抗旱性較強[14-16]，而‘東農303’抗旱性較弱[17,18]。其他品種（系）的抗旱性不確定。各品種生育特性見表1。

PEG-8000 購于Amresco 公司，化學式為HO（CH2CH2O）nH，n=108～125，純度99.9%。

1.2 試驗方法

1.2.1 PEG培養(yǎng)基制作

參考鄧珍等[19]的方法，配制0、5%、10%、15%、20%（W/V）的PEG溶液（含2 mmol/L MES緩沖液），pH調至5.8±1，高壓滅菌。之后等體積倒入已滅菌凝固的MS 培養(yǎng)基（瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L）中，平衡72 h后，在無菌工作臺上把上層液體從培養(yǎng)瓶中倒掉。所得的固體培養(yǎng)基即為含PEG固體培養(yǎng)基。其中0處理不添加PEG，設為對照。

表1 品種（系）特性介紹Table 1 Characteristics of varieties(lines)

1.2.2 試驗處理

將在常規(guī)培養(yǎng)基中預培養(yǎng)長勢一致的馬鈴薯脫毒苗，按單節(jié)莖段剪切到PEG培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。每瓶接入12 個莖段，每個處理80 瓶。培養(yǎng)瓶直徑0.65 cm，內裝40 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度（23±2）℃，光強3 000 lx，每天光照16 h。培養(yǎng)50 d后測定各指標，每個品種（系）每次取3個重復，每個重復3瓶。

1.2.3 葉綠素及類胡蘿卜素含量測定

取新鮮干凈試驗材料，剪碎稱取0.1 g，加入少量石英砂和微量CaCO3，加入2～3 mL無水乙醇研磨成勻漿，再加入10 mL無水乙醇研磨至組織變成白色，靜置3～5 min。濾紙和漏斗用無水乙醇濕潤后，將提取液過濾到25 mL棕色容量瓶里，用無水乙醇反復沖洗研缽和漏斗，定容到刻度線[20]。使用UV-5800型紫外可見光分光光度計測定665，649和470 nm的OD值，空白組為無水乙醇溶液。

結果計算：

Ca=13.95×OD665-6.88×OD649

Cb=24.96×OD649-7.32×OD665

Ct=Ca+Cb

Ch=（1 000×OD470-2.05Ca-114.8Cb）/245

葉綠素含量=[色素濃度（C）×提取液體積×稀釋倍數]/樣品鮮重（或干重）

式中：Ca 為葉綠素a 濃度；Cb 為葉綠素b 濃度；Ct為總葉綠素濃度；Ch為類胡蘿卜素濃度。

1.2.4 數據分析

數據統(tǒng)計和作圖采用Excel 2013進行。方差分析、鄧肯氏多重比較和因子分析采用SPSS 20。采用平均隸屬函數法進行綜合分析。

隸屬函數值公式為：Ui=（Xi-Ximin）/（Ximax-Ximin）

式中：Ui為第i個指標的的隸屬函數值；Xi為第i個指標的原始數據；Ximax和Ximin為樣品組中第i個指標的最大值與最小值[21]。

相對指標=（處理指標/對照指標）×100%[19]

2 結果與分析

2.1 不同濃度PEG脅迫對馬鈴薯試管苗葉綠素a含量的影響

由表2看出，‘D613’葉綠素a含量隨PEG濃度升高而升高，分析‘D613’以外的其他品種（系），在5%PEG脅迫下，各品種（系）葉綠素a含量均較對照低，‘東農303’降低幅度最大。在10%PEG 脅迫下，‘東農303’和‘200902’葉綠素a含量繼續(xù)降低，而‘渭薯1號’、‘青薯9號’和‘春薯2號’葉綠素a含量回升。在15%PEG脅迫下，各品種（系）葉綠素a含量均較10%PEG 脅迫下升高，其中‘渭薯1 號’、‘D613’、‘青薯9號’和‘春薯2’號的葉綠素a含量超過對照。20%PEG 脅迫下，‘200902’和‘春薯2 號’的葉綠素a含量較15%PEG脅迫下略降低，其他品種持續(xù)升高，其中‘D613’、‘渭薯1號’和‘青薯9號’葉綠素a含量超過對照，分別是對照的2.05、1.55和1.37 倍。變異系數最大的為‘D613’，其次是‘東農303’，最小為‘青薯9號’。

表2 不同濃度PEG脅迫下馬鈴薯試管苗葉綠素a含量（mg/g FW）Table 2 Chlorophyll-a contents of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

2.2 不同濃度PEG脅迫對馬鈴薯試管苗葉綠素b含量的影響

由表3 看出，除‘D613’葉綠素b 鮮樣含量隨PEG濃度升高而升高，其他品種（系）均表現為先降低后升高的趨勢。分析‘D613’以外的其他品種（系），在5%PEG脅迫下，各品種（系）葉綠素b含量均低于對照，‘東農303’降低幅度最大，其次是‘渭薯1號’。在10%PEG脅迫下，‘東農303’和‘200902’葉綠素b含量繼續(xù)降低，而‘渭薯1號’、‘青薯9號’和‘春薯2 號’葉綠素b 含量回升。在15%PEG 脅迫下，各品種（系）葉綠素b含量均較10%PEG脅迫下升高，其中‘渭薯1號’、‘青薯9號’的葉綠素b含量超過對照。20%PEG脅迫下，‘200902’和‘春薯2號’的葉綠素b含量較15%PEG脅迫下略降低，其他品種持續(xù)升高，其中‘渭薯1號’和‘青薯9號’葉綠素b含量超過對照。

2.3 不同濃度PEG脅迫對馬鈴薯試管苗類胡蘿卜素含量的影響

由表4看出，除‘D613’類胡蘿卜素含量隨PEG濃度升高而升高，其他品種（系）均表現為先降低后升高的趨勢。分析‘D613’以外的其他品種（系），在5%PEG脅迫下，各品種（系）類胡蘿卜素含量均低于對照，‘渭薯1號’降低幅度最大，其次是‘春薯2號’。在10%PEG脅迫下，各品種（系）較5%PEG脅迫下類胡蘿卜素含量回升。在15%PEG脅迫下，除‘春薯2號’，其他各品種（系）類胡蘿卜素含量均較10%PEG脅迫下升高且超過對照。20%PEG脅迫下，各品種的類胡蘿卜素含量均超過對照，‘D613’的類胡蘿卜素含量是對照的5.52倍，其次是‘青薯9號’，為對照的1.86倍，最低的是‘200902’，為對照的1.13倍。

表3 不同濃度PEG脅迫下馬鈴薯試管苗葉綠素b含量（mg/g FW）Table 3 Chlorophyll-b contents of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

表4 不同濃度PEG脅迫下馬鈴薯試管苗類胡蘿卜素含量（mg/g FW）Table 4 Carotenoid contents of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

2.4 不同濃度PEG脅迫對馬鈴薯試管苗總葉綠素含量的影響

由表5看出，除‘D613’總葉綠素含量隨PEG濃度升高而升高，其他品種（系）均表現為先降低后升高的趨勢。分析‘D613’以外的其他品種（系），在5%PEG 脅迫下，各品種（系）總葉綠素含量均低于對照，‘東農303’降低幅度最大，其次是‘渭薯1號’。在10%PEG脅迫下，‘東農303’和‘200902’總葉綠素含量繼續(xù)降低，而‘渭薯1號’、‘青薯9號’和‘春薯2號’總葉綠素含量回升。在15%PEG脅迫下，各品種（系）總葉綠素含量均較10%PEG脅迫下升高，且‘渭薯1號’、‘青薯9號’和‘春薯2號’超過對照。20%PEG脅迫下，‘渭薯1號’和‘青薯9號’總葉綠素含量超過對照。

2.5 不同濃度PEG脅迫對馬鈴薯試管苗胡蘿卜素/總葉綠素比值的影響

由表6看出，胡蘿卜素/總葉綠素的比值變化趨勢不一致，‘D613’隨PEG濃度升高而升高，‘渭薯1號’和‘青薯9 號’呈現出先降低后升高的趨勢，‘200902’呈現出先升高后略降低的趨勢。在5%PEG下，‘渭薯1號’和‘青薯9號’的比值分別是對照的0.75和0.97倍，而‘東農303’的增幅最大，是對照的1.50 倍。在20%PEG 下，‘東農303’和‘D613’分別是對照的2.45和3.09倍，而‘渭薯1號’和‘青薯9號’分別是對照的1.12和1.22倍。

表5 不同濃度PEG脅迫下馬鈴薯試管苗總葉綠素含量（mg/g FW）Table 5 Total chlorophyll contents of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

表6 不同濃度PEG脅迫下馬鈴薯試管苗類胡蘿卜素/總葉綠素Table 6 Carotenoid/total chlorophyll of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

2.6 不同濃度PEG脅迫對馬鈴薯試管苗葉綠素b/a的影響

由表7看出，在0～20%PEG，各品種（系）葉綠素b/a濃度的值變化略微呈先升高后降低的趨勢，與總葉綠素含量的變化趨勢相反。對照處理中，‘青薯9號’的比值最大，‘D613’比值最小，分別為0.280和0.262。其中‘200902’的變異系數最大，為12.47%，‘D613’變異系數最小，為5.74%。

2.7 馬鈴薯試管苗各生長指標在不同濃度PEG脅迫下變異分析

為篩選鑒定不同品種馬鈴薯組培苗對干旱脅迫反應的最佳PEG濃度，分析了不同濃度PEG下各指標在不同品種間的變異系數（表8）。各指標在不同PEG濃度下的變異系數不同，葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素/總葉綠素變異系數在對照下最大，類胡蘿卜素變異系數在5%PEG 下最大，為46.33%，在15%PEG下最小。為綜合考慮相同PEG濃度下各指標的變異性，采用隸屬函數法對各指標的變異系數進行轉換，分別計算各指標的隸屬函數值，比較平均隸屬函數值，值越大，說明變異越大。

表7 不同濃度PEG脅迫下馬鈴薯試管苗葉綠素b/葉綠素aTable 7 Chlorophyll-b/chlorophyll-a of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

表8 不同濃度PEG下品種間各指標的變異系數（%）Table 8 Coefficients of variation under different PEG concentrations

綜合表2～8的結果可以看出，對照的變異系數最大，說明在不含PEG的處理中，不同品種由于遺傳基礎不同即使在完全相同的生長條件下生長也不一致；在含有PEG的培養(yǎng)基中，馬鈴薯組培苗受到干旱脅迫生長受到影響，各生理指標發(fā)生變化，20%PEG 脅迫下的平均隸屬函數值較5%、10%和15%PEG脅迫下的值高，表明在20%PEG脅迫下品種之間測得的指標值差異較大。

通過各指標的變異系數比較，發(fā)現類胡蘿卜素、類胡蘿卜素/總葉綠素的變異系數較大，說明這2 個指標對干旱較敏感，而葉綠素b/a 變異系數較小，說明該指標在干旱脅迫下可以保持一定的穩(wěn)定性。

2.8 馬鈴薯試管苗各生長指標在不同濃度PEG脅迫下變異分析

計算分析各品種（系）指標在不同濃度PEG間的變異系數的隸屬函數值（表9），在0～20%PEG濃度梯度不同，各指標的變異系數的隸屬函數值不同，葉綠素a變異系數的隸屬函數值‘D613’最大，‘青薯9號’最小，類胡蘿卜素變異系數的隸屬函數值‘D613’最大，‘東農303’最小。采用平均隸屬函數值法對各品種（系）的指標變異系數進行綜合分析，從結果可以看出，變異系數的隸屬函數值從大到小依次為‘D613’、‘東農303’、‘200902’、‘渭薯1 號’、‘春薯2號’和‘青薯9號’。平均隸屬函數值越大，說明該品種（系）受脅迫影響導致的生理生長變化越大。

表9 不同品種（系）各指標變異系數的隸屬函數值Table 9 Subordinate function value of coefficients of variation under different PEG concentrations

3 討 論

一般認為對水分脅迫敏感性高的品種總葉綠素含量變幅較大，抗旱性差[19]。聶華堂[20]認為抗旱性越強的樹種干旱脅迫下葉綠素含量降幅越小。馮淑華[21]研究發(fā)現植物在水分脅迫時，葉綠素含量增加。楊寧等[22]研究高山離子芥試管苗幼苗發(fā)現，PEG脅迫下葉片總葉綠素含量呈現先升高后下降的趨勢?？蛊G紅等[23]利用PEG處理正常生長的馬鈴薯組培苗4 d后發(fā)現各處理單位面積上葉綠素含量隨脅迫程度增加表現出下降的趨勢，隨脅迫強度加大，葉綠素含量又有所回升，這與本研究的結果相似。本研究中‘D613’葉綠素a 含量、葉綠素b、總葉綠素含量隨PEG濃度升高而升高，其他品種（系）均表現為先降低后升高的趨勢。馬玉花等[24]研究亦發(fā)現肋果沙棘（Hipphae neu-rocpa）葉片葉綠素a、b及總葉綠素含量從對照到輕度脅迫有微量降低，隨著干旱脅迫程度的加劇，總體均呈現上升趨勢。分析原因可能是不同的植物抗旱機制不同，葉綠素對干旱脅迫的反應不同，彩色馬鈴薯植株的葉綠素含量對干旱的反應與常規(guī)品種不一樣。常規(guī)馬鈴薯品種葉綠素出現先降低后升高的趨勢，其中抗旱性強的品種在低強度干旱脅迫下葉綠素含量降幅小，在高強度干旱脅迫下葉綠素含量增幅大。分析原因可能是輕度干旱脅迫下脅迫減弱葉片葉綠素的生物合成過程，同時加速葉綠素分解，使葉綠素含量有減小的趨勢。隨著干旱脅迫強度加大，時間延長，植株葉片含水率降低，葉片組織液濃縮而使葉片單位面積葉綠素的濃度增加。張麗莉等[25]研究發(fā)現，干旱脅迫后馬鈴薯組培苗葉綠體變形甚至解體。可以推測，植株在輕度或短暫的干旱脅迫下由于葉綠素合成的減緩及葉綠素的解體會直接造成葉綠素含量降低，隨著干旱脅迫的加重及干旱時間的延長，植株通過自身調節(jié)機制，如葉片含水量的降低，葉片組織液濃縮，甚至是反饋性的提高葉綠素合成速率，以提高單位面積的葉綠素含量，減緩單位面積光合速率降低的速度，從而維持機體生長所需要的能量合成。實際生產中，作物在受到一定程度的干旱脅迫后亦有表現出葉色更綠更暗的現象。而隨著脅迫強度的進一步提高，在20%PEG下，‘春薯2號’和‘200902’的葉綠素a、b 及總葉綠素含量又出現下降，分析原因，可能是該品種的抗旱體系受到更高程度的傷害，通過提高單位面積的葉綠素含量減緩單位面積光合速率降低速度的機制已經被破壞。推測隨著脅迫時間的延長，或者PEG濃度的更高，其他品種的葉綠素含量也會出現降低的現象。文愛華等[8]自然失水脅迫處理米槁（Cinnamomum migao H. W. Li）22 d發(fā)現隨著脅迫時間的增加，葉綠素a、b含量呈先降低后升高再降低的趨勢。

本試驗中，類胡蘿卜素含量除‘D613’隨PEG濃度升高而升高，其他品種（系）均表現為先降低后升高的趨勢。其趨勢與葉綠素含量變化較接近，但其相對降幅和相對增幅都較葉綠素大，說明類胡蘿卜素含量對干旱脅迫的反應比葉綠素更敏感。常規(guī)品種類胡蘿卜素出現先降低后升高的趨勢，其中抗旱性強的品種在低強度干旱脅迫下含量降幅小，在高強度干旱脅迫下含量增幅大。分析原因可能是輕度干旱脅迫下脅迫減弱葉片類胡蘿卜素的生物合成過程，使類胡蘿卜素含量有減小的趨勢，隨著干旱脅迫強度加大，時間延長，植株葉片含水率降低，葉片組織液濃縮，同時誘導了類胡蘿卜素相關基因的表達而使葉片單位面積類胡蘿卜素的濃度增加。文愛華等[8]研究亦發(fā)現米槁的類胡蘿卜素含量隨干旱脅迫時間的增加先下降后上升。有研究證明干旱脅迫下馬鈴薯β-胡蘿卜素羥化酶1基因表達增加，推測干旱會誘導類胡蘿卜素的合成[26]。

張明生和談鋒[27]提出葉綠素a/b比值可以判斷植物的抗旱能力。張武[28]研究認為干旱地區(qū)馬鈴薯葉片中葉綠素b/a比值與品種抗旱性呈極顯著正相關，比值越大品種抗旱性愈強。本試驗中各品種（系）對照間的葉綠素b/a值差異不大，是否與抗旱性相關有待進一步考證。各品種（系）葉綠素b/a值在不同PEG處理間的變異系數較其他指標的變異系數小，說明該指標較其他指標在干旱下更穩(wěn)定。黃承建等[29]研究亦發(fā)現苧麻受長時間嚴重干旱脅迫對葉綠素a/b值影響很小。牟筱玲和鮑嘯[30]在對棉花的研究中亦發(fā)現葉綠素a/b比值基本不變。在本研究中，b/a值變化略微呈先升高后降低的趨勢，與總葉綠素含量的變化趨勢相反，總葉綠素先降低后升高，說明在總葉綠素含量降低的過程中，葉綠素a 濃度降低更快，而在總葉綠素含量升高的過程中，葉綠素a升高的速度更快，表明葉綠素a比葉綠素b對干旱的反應更為敏感。這與馬玉花等[24]研究發(fā)現肋果沙棘葉片在嚴重干旱下葉綠素a相對葉綠素b變化更大的結果相一致。

本研究中類胡蘿卜素/總葉綠素值的比值整體有升高的趨勢，這與許麗穎[31]對李樹的研究結果一致?？购敌栽綇姷钠贩N，比值越穩(wěn)定，抗旱性越弱的品種，受干旱脅迫比值升高越高。分析原因為抗旱性越強的品種，葉綠素較類胡蘿卜素的含量穩(wěn)定，在輕度干旱脅迫下，2種色素的含量降幅越小，其中類胡蘿卜素比葉綠素含量下降更快，所以比值降低，而在中度干旱脅迫下，葉綠素和類胡蘿卜素含量上升，類胡蘿卜素含量上升更快，所以比值升高。而抗旱性越弱的品種，輕度干旱脅迫下，2種色素的含量受影響，降幅越大，其中類胡蘿卜素較葉綠素下降慢，所以比值升高，在中度脅迫下，葉綠素和類胡蘿卜素含量上升，類胡蘿卜素含量上升更快，所以比值持續(xù)升高。在色素含量上升過程中，抗旱性強的品種比值較穩(wěn)定，而抗旱性差的品種該比值升高幅度大，推測原因可能是抗旱性差的品種較抗旱性強的品種中葉綠素含量增高的速度比類胡蘿卜素增高的速度更慢。

鄧珍等[19]研究認為，固體培養(yǎng)下15%PEG-8000濃度下品種間差異最大，是鑒定馬鈴薯品種組培苗對干旱脅迫反應的最佳濃度。李志燕[32]認為，固體培養(yǎng)條件下8%PEG-6000濃度為鑒定和評價不同馬鈴薯品種之間耐旱性強弱的最佳濃度。王謐[14]研究認為，濃度為5%PEG-6000下馬鈴薯生長指標變化達到顯著差異。本研究結果為固體培養(yǎng)下20%PEG-8000脅迫下培養(yǎng)40 d能更好地反應馬鈴薯組培苗受PEG模擬干旱脅迫后各品種之間葉綠素和類胡蘿卜素含量變化的差異。

不同品種受干旱影響后各指標的變異系數不同，可能與不同品種抗旱機制不同有關。‘D613’在干旱條件下會積累更多的葉綠素和類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的積累比葉綠素更多，或許在干旱脅迫下，彩色品種利用增加色素來應對逆境的機制更發(fā)達，而常規(guī)品種其他抗旱機制更發(fā)達。其他各品種（系）的葉綠素和類胡蘿卜素含量在低濃度PEG 脅迫下有輕度的下降趨勢，而‘D613’并沒有體現，推測是彩色品種色素含量變化對干旱更敏感，在極輕度的干旱脅迫下就會使色素含量降低，隨之誘導了色素的加速合成，這個極輕度的干旱脅迫或許比5%PEG 更低，未在本試驗設置范圍內。本研究中各品種（系）在受干旱脅迫時所導致的葉綠素和類胡蘿卜素相關指標變化程度與抗旱綜合評價的結果并不完全一致，彩色品種‘D613’的變化最大，抗旱綜合評價其抗旱性最強，而其他常規(guī)品種（系）結果相反，整體呈現出抗旱性強的品種受干旱導致的指標變化程度小，而抗旱性弱的品種受影響大，所以對彩色馬鈴薯和常規(guī)馬鈴薯進行抗旱評價時如果單采用色素指標，并不能全面綜合反映出植株的抗旱性。

馬鈴薯干旱脅迫下生理變化過程復雜，并且隨著脅迫強度和脅迫時間的變化而有所不同，因此無法簡單的用某一項或者幾項生理值的變化作為抗旱性鑒定的指標。因此，今后抗旱鑒定工作的重點應從分子水平上闡明馬鈴薯抗旱機制，選用正確的綜合性抗旱評價方法，提高馬鈴薯抗旱性鑒定的科學性和準確性。