陳 倫，陳霽暉，張 青，黃曉會，李莉霞，卜書紅

0 引言

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于乙狀結腸和直腸交界處，有較高的發(fā)病率和病死率。研究認為，腫瘤發(fā)生為多基因的病理反應[1]。近年來，隨著分子遺傳學、基因組學的快速發(fā)展，相關研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞基因型不僅參與腫瘤分化、增殖及預后，還與癌細胞對化療藥物的敏感性相關，基因預測化療藥物毒副反應備受臨床關注[2]。伊立替康為中晚期結直腸癌的常用化療藥物，在肝臟內可快速水解為活性產(chǎn)物7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，抑制DNA單鏈斷裂后修復，影響DNA復制及轉錄，引起腫瘤細胞凋亡，從而起到治療作用[3]。但SN-38主要通過尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶家族(UGTs)在肝臟中代謝，UGT1A1基因變異可降低UGT1A1表達，減少SN-38轉化，增加伊立替康所致的不良反應[4-5]。既往研究報道，UGT1A1基因多態(tài)性和伊立替康所致的腹瀉、中性粒細胞減少有一定關系[6]，但此結論尚存爭議。本研究旨在探討UGT1A1基因與伊立替康致結腸癌患者腹瀉及中性粒細胞減少的關系，從而指導臨床個體化用藥。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2017年5月至2018年4月入院治療的60例結腸癌患者，入選標準[7]：均經(jīng)病理組織活檢確診為結腸癌；心肝腎等功能無明顯異常；預計生存時間超過3個月；距離最近1次化療或者手術時間超過4周；有可測量病灶。排除標準：接受放療；其他惡性腫瘤病史；嚴重多器官功能障礙；消化道及黃疸梗阻；造血功能不全；妊娠或者哺乳階段；既往接受過伊立替康治療；本研究藥物過敏禁忌證。男36例，女24例；年齡36～74歲，平均(60.35±9.38)歲；低分化腺癌23例，中、高分化腺癌37例。

1.2 治療方法 患者入院后均采用伊立替康聯(lián)合氟尿嘧啶治療，靜脈滴注125～180 mg/m2伊立替康，第1天；靜脈滴注400 mg/m2氟尿嘧啶和亞葉酸鈣200 mg/m2，第1～2天，1 600 mg/m2靜脈泵注維持46 h，3周為1個周期，均治療2～4個周期，患者出現(xiàn)嚴重不良反應時，暫停給藥并給予對癥治療，待恢復至≤1級后再繼續(xù)治療，并將伊立替康劑量下調1個單位25 mg/m2。

1.3UGT1A1基因分型 收集患者治療結束時外周靜脈血3 ml，放置在抗凝管中，保存在-20 ℃低溫冰箱中待檢。取400 μl全血在2 ml離心管中，加入10 μl蛋白酶K、90 μl 10%異丙醇、410 μl STE溶液，搖晃2 min，放置在65 ℃水浴鍋中消化過夜。在充分消化血樣中加入300 μl飽和氯化鈉溶液，混勻后加入400 μl氯仿，混合均勻后在20 ℃環(huán)境中，在12 000 r/min離心機下離心20 min。將上清液轉移至1.5 ml離心管中，鍵入等體積的-20 ℃預冷異丙醇，混合均勻后，在4 ℃環(huán)境下離心15 min，除去上清液。在離心管中加入-20 ℃預冷75%乙醇溶液，按照以上離心條件離心15 min，去除上清液。并重復1次以上操作，室溫條件下晾干沉淀，加入100 μl Mili-Q水解液進行沉淀。取1 μl DNA樣本，取1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本質量，采用分光光度計測定樣本濃度及純度。取Mili-Q水稀釋樣本至10 ng/μl備用。參照Genbank的UGT1A1基因序列及配套軟件設計UGT1A1基因藥物遺傳多態(tài)性位點特異性引物(UGT1A1*28：rs8175347，UGT1A1*6：rs4148323)。全部引物均由配套試劑盒提供，引物母液濃度為100 μmol/L，稀釋所有引物為1～10 μmol/L備用。取人外周血DNA為模板進行PCR擴增反應，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產(chǎn)物。用人外周血DNA為模板進行touch down PCR擴增，采用HRM方法進行測定，用Bipedit軟件進行序列比對，并分析基因類型。

第1步不提取DNA，第2步不進行擴增。取患者外周血2 ml，EDTA抗凝處理；采用北京華夏時代基因發(fā)展科技有限公司提供的測序反應通用試劑盒，并嚴格按照說明書操作。提取白細胞后，采用熒光檢測儀對UGT1A1*28(rs8175347)和UGT1A1*6(rs4148343)位點進行檢測。

1.4 藥物毒性評價標準 患者入院后均查閱病歷，記錄性別、年齡、ECOG評分、轉移器官數(shù)目等資料。每個化療周期后，均查閱患者血液學檢查、病史等。采用美國國家研究所不良反應分度標準4.0[8]評估患者化療后腹瀉、中性粒細胞減少情況，包含0～4級。①腹瀉。0級：無，1級：大便次數(shù)每天增加2～3次，2級：大便次數(shù)每天增加4～6次或者中度腹痛、夜間大便，3級：大便每天增加7～9次或者嚴重腹痛或者大便失禁，4級：大便每天增加10次或者需腸外支持治療或者明顯血性腹瀉。②中性粒細胞減少。0級：中性粒細胞≥2.0×109/L；1級：中性粒細胞1.5×109/L～1.9×109/L；2級：中性粒細1.0×109/L～1.4×109/L；3級：中性粒細胞0.5×109/L～0.9×109/L；4級：中性粒細胞<0.5×109/L。其中3、4級為嚴重不良反應。

1.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0軟件包，計數(shù)資料用率(%)表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，單因素分析有意義的因素用Logistic回歸方程進行多因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1UGT1A1不同基因型和伊立替康致腹瀉及中性粒細胞減少的關系UGT1A1*28、UGT1A1*6突變基因型患者腹瀉、中性粒細胞減少發(fā)生率均分別高于野生型患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 結腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細胞減少的單因素分析 單因素分析顯示，結腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細胞減少0～4級患者在不同性別、年齡、轉移器官數(shù)目、UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量中比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在不同ECOG評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、表3。

2.3 結腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細胞減少的Logistic回歸分析 將可能導致嚴重腹瀉、中性粒細胞減少的性別、年齡、轉移器官數(shù)目、UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量等因素納入Logistic回歸方程進行分析，結果顯示，UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量是結腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細胞減少的獨立危險因素，見表4、表5。

3 討論

結腸癌是嚴重危及患者生命安全的惡性腫瘤，近年來，隨著人們生活環(huán)境、飲食習慣的改變，其發(fā)生率呈上升趨勢。結腸癌的早期癥狀隱匿，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者糾正時已為中晚期，化療是此類患者的重要治療手段。

伊立替康為半合成的可溶性喜樹堿衍生物，主要作用于細胞周期S期，通過抑制拓撲異構酶Ⅰ，代謝為SN-38，影響DNA復制及細胞分裂，導致腫瘤細胞死亡[9-10]。盡管伊立替康在結腸癌治療中的效果已得到研究證實[11-12]，但隨著其在臨床的廣泛應用，其所致的腹瀉及中性粒細胞減少等不良反應較為突出，限制其使用。機體肝細胞內SN-38在UGT1A1作用下轉化為SN-38G，通過膽汁排泄至腸道后，在β-葡萄糖醛酸酶作用下轉化為SN-38，血液及腸道中高濃度的SN-38又增加血液學毒性風險，增加腸壁炎癥細胞滲透性，促進水及電解質的分泌，導致內環(huán)境改變，腸道內菌群失調，從而引起腹瀉[13-14]。UGT1A1又可促進SN-38轉化為SN-38G，從而減輕其不良反應。侯慧軒等[15]研究發(fā)現(xiàn)，中國患者出現(xiàn)伊立替康致嚴重不良反應的發(fā)生率較歐美國家低，此差異一方面可能和國內化療劑量有關，另一方面，有研究報道，UGT1A1基因多態(tài)性分布有明顯的種族差異，可能導致伊立替康在不同個體中的毒性反應存在差異[16]。因此，分析UGT1A1基因多態(tài)性和伊立替康不良反應間的關系有重要價值。

UGT1A1基因位點有多種突變，其中UGT1A1基因第28位點的啟動子區(qū)TATA盒中的TA數(shù)目重復疊加差異可影響此基因多態(tài)性，TA插入延長或者減少縮短均可減少UGT1A1基因合成，影響酶功能[17]。TA6/TA6是UGT1A1*28基因最常見的野生基因型，啟動子區(qū)其次重復的主要為TA6/TA7雜合突變型。UGT1A1*6基因是由UGT1A1第一外顯子211位點出現(xiàn)單核苷酸替換所致，主要為野生型及雜合突變型，作用上和UGT1A1*28基因相似，能夠調控UGT1A1基因活性，此基因突變能夠降低患者對SN-38的代謝能力[18]。

表1 UGT1A1不同基因型和伊立替康致腹瀉及中性粒細胞減少的關系(例，%)

表2 結腸癌患者伊立替康致腹瀉的單因素分析(例，%)

表3 結腸癌患者伊立替康致中性粒細胞減少的單因素分析(例，%)

表4 結腸癌患者伊立替康致腹瀉的Logistic回歸分析

表5 結腸癌患者伊立替康致中性粒細胞減少的Logistic回歸分析

陳茹等[19]研究報道，UGT1A1基因多態(tài)性可增加伊立替康治療結腸癌患者腹瀉、中性粒細胞減少的危險性。本研究結果顯示，UGT1A1*28基因、UGT1A1*6基因型和嚴重腹瀉、中性粒細胞減少患者有良好相關性，以上基因突變型患者腹瀉的發(fā)生率明顯高于野生型，同時Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，性別、年齡、轉移器官數(shù)目和嚴重腹瀉、中性粒細胞減少的發(fā)生無關，排除了其對伊立替康所致毒性反應的影響，進一步說明UGT1A1基因多態(tài)性和腹瀉的關系。臨床治療實踐中，不可避免地根據(jù)患者自身經(jīng)濟、個人體質等調整伊立替康劑量，可能影響伊立替康所致不良反應，既往已有研究報道，伊立替康不良反應受化療劑量的影響[20]，本研究也支持此結論，因此，臨床應綜合考慮UGT1A1*28、UGT1A1*6的影響。但本研究未進一步分析伊立替康劑量和UGT1A1的關系，加上樣本量缺乏代表性，因此UGT1A1基因型和伊立替康劑量的關系認識尚需大樣本研究證實，加上性別、年齡、轉移器官數(shù)目等因素可能存在一定的交互影響，進一步分析各個因素之間的相關性，得出的結果可能更加可靠。

綜上所述，UGT1A1基因與伊立替康所致結腸癌患者腹瀉及中性粒細胞減少有關，可為臨床伊立替康不良反應的干預及用藥選擇提供理論依據(jù)。