高歡歡　曾凡江　趙秀芳　朱心寧　郭自春　張波　丁澤華

摘要 本研究利用高通量測(cè)序法（Miseq測(cè)序平臺(tái)）對(duì)塔克拉瑪干沙漠南緣2種多年生植物根際土壤微生物進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，駱駝刺根際土壤中細(xì)菌分為16門(mén)、33綱、67目、129科、320屬，檉柳根際土壤中細(xì)菌分為14門(mén)、30綱、66目、125科、335屬;駱駝刺根際土壤中真菌分為8門(mén)、13綱、36目、58科、104屬，檉柳根際土壤中真菌分為8門(mén)、13綱、34目、59科.92屬。2種植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)種間存在差異，真菌差異大于細(xì)菌且豐度高。

關(guān)鍵詞 根際微生物;高通量測(cè)序;多樣性Miseq測(cè)序平臺(tái);塔克拉瑪干沙漠

中圖分類(lèi)號(hào) S154.36

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）08-0161-03

根際這一概念最早在1904年由德國(guó)科學(xué)家Hitner提出，是指根和土壤及其中間的一切物質(zhì)。根際微生物在根際生態(tài)中占據(jù)重要地位，它能自由穿梭于根際中的“自由空間”，鏈接植物一土壤，參與養(yǎng)分運(yùn)輸與能量轉(zhuǎn)換"。沙漠是典型的干旱生態(tài)系統(tǒng)，降雨稀少、沙漠化嚴(yán)重、土壤養(yǎng)分貧瘠是其主要特點(diǎn)叫，但是在世界各地沙漠的土壤中都發(fā)現(xiàn)了豐富的微生物，可培養(yǎng)數(shù)量達(dá)1.6x107個(gè)/gH。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，高通量技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中廣泛應(yīng)用，更多種類(lèi)的微生物區(qū)系已經(jīng)在荒漠生態(tài)系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)也為根際微生物生態(tài)學(xué)的研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

塔克拉瑪干沙漠南緣是典型的干旱生態(tài)系統(tǒng)，也是我國(guó)土地沙漠化最嚴(yán)重的地區(qū)之一?；哪脖皇蔷S系干旱區(qū)生態(tài)系統(tǒng)安全的基礎(chǔ)，加速自然植被的修復(fù)與重建依賴(lài)于主要植物生態(tài)學(xué)特性的深入了解。駱駝刺和檉柳作為這一地區(qū)的主要物種，在塔克拉瑪干沙漠南緣形成優(yōu)勢(shì)群落，在防風(fēng)固沙、維護(hù)脆弱過(guò)渡帶生態(tài)中起到重要作用8駱駝刺作為豆科多年生木質(zhì)化草本，具有較高含量的蛋白質(zhì)，是家畜優(yōu)良的飼料四。此外，駱駝刺植株可以分泌刺糖和油脂，具有良好的藥用價(jià)值"0，檉柳根系寄生著有沙漠人參之稱(chēng)的管花肉蓯蓉叫，2種植物都有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是由于過(guò)渡區(qū)開(kāi)墾和藥材采集過(guò)程中人類(lèi)的過(guò)度砍伐和挖掘，2種植物受到了嚴(yán)重破壞。以往研究中主要關(guān)注水分、養(yǎng)分、鹽分對(duì)其植被修復(fù)的影響12-14，未能探究根際微生態(tài)過(guò)程中能量與物質(zhì)的轉(zhuǎn)換機(jī)制。因此，探索根際微生物群落結(jié)構(gòu)可為深人研究根系微生態(tài)中植物微生物一土壤協(xié)同作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)1。

本研究中基于第二代16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)，初步探討了駱駝刺和檉柳根際士壤中細(xì)菌、真菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性及其差異，為今后進(jìn)一步揭示根際微生態(tài)過(guò)程中養(yǎng)分循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換提供參考和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1研究區(qū)概況

本研究依托策勒荒漠草地生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站開(kāi)展。研究區(qū)位于策勒綠洲前沿。策勒位于昆侖山北麓，塔克拉瑪干沙漠南緣，地處東經(jīng)80*03'24"～82°10'34"，北緯35917'55"～3930'00"。年平均合氣溫11.9C，極端最高氣溫41.9C，極端最低氣溫-23.9C年均降水量35.1mm，主要集中在5月和7月.蒸發(fā)量高達(dá)2595.3mm，干燥度20.8，無(wú)霜期平均約為209d，屬于暖溫帶極端千旱區(qū)。年平均風(fēng)速1.9m/s，沙塵暴和降塵是這一區(qū)域的主要生態(tài)災(zāi)害。策勒綠洲有9條季節(jié)性河流，均屬于降水、積雪融水和冰川融水綜合補(bǔ)給性河流。當(dāng)昆侖山的融雪水超出河流容量時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)夏季（7-8月）洪水。駱駝刺和檉柳是沙漠綠洲過(guò)渡帶最重要的2種多年生植物。

1.2研究方法

1.2.1根際土壤取樣。在沙漠綠洲過(guò)渡帶駱駝刺和檉柳天然群落中各選取3個(gè)10mx10m的樣方，每個(gè)樣方中選取3～5株長(zhǎng)勢(shì)良好的植株進(jìn)行挖掘，挖掘深度為1m。用抖土法抖落根上附著的土壤，用無(wú)菌刷刷取根上附著的土壤作為根際土將土壤樣品放入無(wú)菌袋中儲(chǔ)存在4C冰箱中。將3個(gè)樣方獲取的部分根際土混合均勻，過(guò)0.2mm篩，-70C冷凍以備DNA的提取。其余根際土風(fēng)干后過(guò)0.2mm篩，用于土壤理化性質(zhì)的鑒定。

1.2.2土壤理化性質(zhì)檢測(cè)。土壤含水量用鋁盒法測(cè)定;土壤總有機(jī)碳含量用總有機(jī)碳分析儀檢測(cè)（德國(guó)Elementar公司）;土壤總氮含量用自動(dòng)凱氏定氮儀檢測(cè)（丹麥福斯公司）;土壤速效磷用0.5mol/L碳酸氫鈉浸提，用鉬銻抗比色法測(cè)定;將土壤與蒸餾水按1：5質(zhì)量比混勻用pH計(jì)和電導(dǎo)儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定pH值和電導(dǎo)率。

1.2.3DNA提取與擴(kuò)增。土壤總DNA用Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒按說(shuō)明提取。提取后用去RNA酶進(jìn)行去RNA處理。

利用Qubit2.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加人的DNA量。利用Miseq焦磷酸測(cè)序平臺(tái)對(duì)2種植物根際土壤細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行鑒定間。細(xì)菌PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物（融合341F引物為CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG;融合805R引物為GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）。真菌PCR所用的引物同樣已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的真菌通用引物（融合MSQ一NS1引物為CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GTAGTCATATGCTTGTCTC;融合MSQ-Fung引物為GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAATTCCCCGTTACCCGTTG）。PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)。

1.2.4測(cè)序數(shù)據(jù)處理及微生物群落組成鑒定。數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過(guò)各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對(duì)各樣本序列做質(zhì)量控制（QC）。QC之后序列長(zhǎng)度大部分分布在400～600bp之間，平均長(zhǎng)度均在440bp以，上，各樣本序列數(shù)均在500以上，滿(mǎn)足基本分析要求。質(zhì)控后的序列長(zhǎng)度為去除barcode、兩端primer、以及部分低質(zhì)量序列的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。將多條序列按其序列間的距離對(duì)它們進(jìn)行聚類(lèi)，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類(lèi)單元（OTU），通常域值的序列相似性定為0.97，操作分類(lèi)單元被認(rèn)為可能接近于屬。

采用軟件RDPclassifier進(jìn)行物種分類(lèi)。RDPclassifier是基于伯杰分類(lèi)，采用NaiveBayesianassignment算法對(duì)每條序列在屬水平上計(jì)算其分配到此序列中的概率值。伯杰分類(lèi)分為5層，它們依次為門(mén)、綱、目、科、屬。

1.2.5微生物群落多樣性分析。利用QIIME（Version1.50）軟件計(jì)算樣品的Alpha多樣性值，計(jì)算Alpha多樣性指標(biāo)，包括豐富度指數(shù)、，Shannon指數(shù)ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)Coverage等。豐富度指數(shù)用于衡量單個(gè)樣本中物種種類(lèi)個(gè)數(shù)，實(shí)際通過(guò)操作分類(lèi)單元（OTU）的個(gè)數(shù)來(lái)計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.12種植物根際土壤理化性質(zhì)對(duì)比

如表1所示，2種植物根際土壤總有機(jī)碳含量差異不顯著（P>0.05）。駱駝刺根際土壤速效磷和pH值顯著高于檉柳根際土壤（P<0.05），總氮含量、電導(dǎo)率及水分含量顯著低于檉柳根際土壤。

2.22種植物根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性比較

2個(gè)樣本序列共聚類(lèi)到26075個(gè)序列，其中駱駝剌根際土含11390個(gè)序列、檉柳根際土含14685個(gè)序列。質(zhì)量控制處理后序列，基于97%的序列相似性，駱駝刺根際土獲得2481個(gè)OTU，檉柳根際土獲得2482個(gè)OTU。多樣性指數(shù)結(jié)果如表2所示。駱駝刺根際土Shannon、ACE、Chaol指數(shù)均大于檉柳根際土，分別為6.752、6653.227、4853.774。Coverage小于檉柳根際土，為0.884。

經(jīng)鑒定駱駝刺根際土壤中細(xì)菌分為16門(mén)、33綱、67目、129科、320屬;檉柳根際土壤中細(xì)菌分為14門(mén)、30綱、66目、125科、335屬。二者在門(mén)、綱、目、科分類(lèi)級(jí)別上有相同的優(yōu)勢(shì)菌，為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、a一變形菌綱（Alphaprote-obacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）.紅螺菌科（Rhodospirillac一eae）;屬級(jí)別優(yōu)勢(shì)菌不同，駱駝刺根際土壤中屬級(jí)別優(yōu)勢(shì)菌為一個(gè)紅螺菌科（Rhodospirillaceae）未被培養(yǎng)鑒定的菌屬，檉柳根際士壤中為Steroidobacter。2種植物根際土中細(xì)菌豐度均超過(guò)1%的有12個(gè)屬（圖1），其中已被鑒定的屬有Escherichia-Shigella、CandidatusMicrothrix、Sphingomonas、Fl一exibacterAzospira、Pelagibius、Planctomyces、Nitratireductor;其余未被培養(yǎng)鑒定，分別為uncultured_Rhodospirillaceae、unc-ultured_Nitrospinaceae、uncultured、Anaerolineaceae、uncultur-ed__Xanthobacteraceae。

2種植物根際土壤中有15個(gè)屬的細(xì)菌豐度差異超過(guò)1%（圖2）。駱駝刺根際土壤中含量較高的有7個(gè)屬，其中已被鑒定的屬有Pseudomonas、Ornithinibacter、Nitrosococcus、Blastocatella;其余未被培養(yǎng)鑒定，分別為uncultured_Gemm-atimonadaceae、uncultured_Rhodospirillaceae、Iachnospiraceae_Incertae_Sedis。檉柳根際土壤中含量較高的有8個(gè)屬，其中已被鑒定的屬為Amycolicicoccus、CandidatusXiphinemato-bacter、Rhizomicrobium、Planctomyces、Steroidobacter、Phenylo-bacterium;其余未被鑒定，分別為uncultured_Erythrobacterac-eae、uncultured_Flammeovirgaceae。駱駝刺根際土特有細(xì)菌有5個(gè)屬（駱駝刺根際士中相對(duì)豐度大于0.1%，檉柳根際土中未出現(xiàn)），其中已被鑒定的屬有Rhodanobacter、Inquilinus、Polaromonas、Pseudaminobacter，uncultured_Peptococcaceae未被培養(yǎng)鑒定。檉柳根際土特有細(xì)菌有2個(gè)屬（檉柳根際土中相對(duì)豐度大于0.1%，駱駝刺根際土中未出現(xiàn)），分別為Reichenbachiella和千維桿菌科（Fib-robacteracea）一個(gè)未被培養(yǎng)鑒定的屬。

2.32種植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性比較

如表2所示，2種植物根際土壤真菌豐度及多樣性值都小于細(xì)菌，2個(gè)樣本真菌序列共聚類(lèi)到49957個(gè)序列，其中駱駝刺根際土含29428個(gè)序列、452個(gè)OTU，檉柳根際土含20529個(gè)序列、326個(gè)OTU。與細(xì)菌多樣性特征一樣駱駝刺根際土Shannon、ACE、Chaol指數(shù)均大于檉柳根際土，分別為3.793、592.684.604.455。

駱駝刺根際土壤中真菌分為8門(mén)、13綱36目、58科、104屬，各分類(lèi)級(jí)別上優(yōu)勢(shì)菌分別為子囊菌門(mén)（Ascomyco-ta）、子囊菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、赤殼科（Nectriaceae）、從赤殼屬（Nectria）;檉柳根際土壤中真菌分為8門(mén)、13綱、34目、59科.92屬，各分類(lèi)級(jí)別上優(yōu)勢(shì)菌分別為子囊菌（Ascomycota）、子囊菌綱（Sordariomycet-es）、散囊菌目（Eurotiales）、發(fā)菌科（Trichocomaceae）、青霉菌屬（Penicillium）。2種植物根際土中真菌豐度均超過(guò)1%的有7個(gè)屬（圖3），分別為Acremonium、Nais、Nectria、Geosmithia、Orbilia、Pleospora、Geopyxis。

2種植物根際土壤中有26個(gè)屬的真菌豐度差異超過(guò)1%（圖4）。駱駝刺根際土壤中含量較高的有13個(gè)屬，分別為Bionectria、Absidia、Beauveria、Phyllosticta、Volutella、Rhiz-ophagus、ThanatephorusActinomucor、GeopyxisMattirolomyces、Geomyces、Knufia、Nectria;檉柳根際土中含量較高的有12個(gè)屬，分別為Penicillium、Cephalotheca、Phoma、PsathyrellaPlu-teus、UlosporaArachnomyces、MicroascusNais、Penidiella、Ma-durellaCochlonema。駱駝刺根際土特有真菌有6個(gè)屬，分別為Mattirolomyces、Metarhizium、Stephanospora、Oxrporus、Col-letotrichum和被孢霉科（Mortierellaceae）一個(gè)未被培養(yǎng)鑒定的屬;檉柳根際土特有真菌有6個(gè)屬，分別為Corollospora、Taifanglania、XylariaCatenu-lostroma、Grosmannia、Diatrype。

3結(jié)論

（1）2種植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)在植物種間存在差異，真菌差異大于細(xì)菌，豐度高。

（2）極端環(huán)境微生物及新發(fā)現(xiàn)菌屬較多，新發(fā)現(xiàn)菌屬分離和功能鑒定在今后的研究工作中仍需要開(kāi)展。

（3）特殊功能型微生物差異與養(yǎng)分等因素具體相關(guān)性和解釋率需要進(jìn)一步研究。

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