王知平，胡 濤

（1.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學院，山西晉中030619； 2.山西省人民醫(yī)院，山西太原030012）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是臨床常見慢性病之一，嚴重威脅患者生活質(zhì)量和生存時間。由于我國居民壽命增長、起居變化、飲食改變等原因，糖尿病的患病率逐年猛增，國際糖尿病學會（IDF）研究表明，2017年我國糖尿病患病人數(shù)居全世界第一，為 1.14 億，年齡調(diào)整患病率為 9.7%［1]。糖尿病患者的死亡原因是嚴重并發(fā)癥的發(fā)展，并發(fā)癥主要損害的是腎、神經(jīng)、血管等器官和組織。其發(fā)病機制尚未完全清楚，但有研究表明其損傷與氧化應(yīng)激引起的細胞凋亡、壞死有密切關(guān)系［2]?；加刑悄虿?，體內(nèi)的高血糖、高血脂、血管緊張素Ⅱ等都可通過各種途徑激活還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶。NADPH氧化酶是活性氧自由基（Reactive oxygenspecies，ROS）產(chǎn)生的主要調(diào)控酶之一，可通過調(diào)控ROS的產(chǎn)生而參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［3]。p22phox是NADPH氧化酶的亞單位之一，可以代表其在細胞中的表達水平。

4－羥基－2，2，6，6－四甲基哌啶（tempol）能夠清除ROS，但機制尚不明確。本研究創(chuàng)建糖尿病大鼠模型，旨在觀察糖尿病氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的主要并發(fā)癥對大鼠腎臟和脊神經(jīng)的損傷，以及用Tempol干預(yù)后，對大鼠腎臟、脊神經(jīng)的保護作用以及對p22phox表達水平的影響，為臨床研究糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展和治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠成年健康雄性（山西醫(yī)科大學實驗動物中心，清潔級），體質(zhì)量（250±25）g，許可證號：SCXK（晉）2014－0001。

1.1.2 實驗試劑Tempo（l美國Sigma公司）；一抗：p22pho（x兔抗大鼠）單克隆抗體，二抗：生物素標記（山羊抗兔）（美國USCN公司）；三抗：辣根酶標記鏈霉卵白素、酶底物顯色劑DAB（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；PBS（磷酸鹽緩沖液）0.01mol/L，PH7.4（博奧森生物技術(shù)公司）；4%多聚甲醛溶液（自配）；30%高糖溶液（自配）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）。

1.1.3 實驗儀器 冰凍切片機（LEICACM1850）；BPH－9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）；DP27顯微數(shù)碼相機（Olympus Japen）；超低溫冰箱（美國Forma公司）；三諾血糖儀（長沙三諾生物傳感股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 SD大鼠若干只（＞30只）適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，參照文獻［4]開始造糖尿病大鼠模型。造模成功后，隨機分為糖尿病組和干預(yù)組，每組8只。另設(shè)正常對照組8只。

1.2.2 給藥 造模成功后，配制10mg/mL的tempol生理鹽水溶液。干預(yù)組每天按60 mg/kg灌胃tempol，正常對照組和糖尿病組每天灌胃等量生理鹽水。3組大鼠實驗期間均正常飲食。

1.2.3 組織收集和冰凍切片 飼養(yǎng)4 w，全部大鼠禁食12 h后稱重麻醉并處死，用灌流針從心尖刺入，沿心腔插入升主動脈。先快速灌注生理鹽水400mL沖出組織中的殘留血液，再緩慢灌注4%的多聚甲醛400mL固定組織。灌注結(jié)束后精心取出固定好的腎、脊髓等組織器官，注意不要損壞，否則影響切片效果，特別是脊髓，由于脊柱包裹必須耐心用骨鉗一點點剝離，留取腎交感神經(jīng)主要傳出的脊髓胸腰段這部分組織。把取出的組織器官先放入提前配好的4%多聚甲醛30min固定，再放入盛有30%蔗糖溶液的棕色瓶中過夜脫水，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

冰凍切片機預(yù)冷30min，設(shè)置好冰臺和冰刀的溫度；從蔗糖溶液瓶中取出腎臟、脊髓，分別用OCT包埋劑包埋凍于冰臺；精心切片，厚度為15μm，漂片法貼于多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上，室溫揮干，保存于－40℃冰箱待用。

1.2.4 免疫組化方法 嚴格按照免疫組化試劑說明書操作。切片出現(xiàn)黃棕色產(chǎn)物時，停止反應(yīng)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性膠封片，37℃烘干，數(shù)碼顯微拍照，統(tǒng)計結(jié)果。脊髓切片由于結(jié)構(gòu)在顯微鏡下不明顯，所以用蘇木素復(fù)染。

1.2.5 觀察指標評價 ①陽性細胞：細胞膜呈現(xiàn)棕黃色圓圈或線條。②陽性細胞百分率：每張切片以逆時針順序，同等條件下取5個40倍視野，分別計算各個視野陽性細胞的百分率，再計算平均值，得出每只大鼠的陽性細胞百分率，再進行統(tǒng)計分析。③陽性強弱評價：以陽性細胞的百分率評價，≥60%為強陽性（+++）、31%～59%為中陽性（++）、6%～30%為弱陽性（+）、＜5%為陰性（－），過表達水平為強中陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用LSD法檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與正常對照組比較，糖尿病足和干預(yù)組腎陽性細胞核脊髓陽性細胞百分率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義；與糖尿病組比較，干預(yù)組腎陽性細胞和脊髓陽性細胞百分率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義；經(jīng)LSD法兩兩比較，3組之間的腎組織和脊髓陽性細胞百分率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。由免疫組化顯微數(shù)碼照片可知，空白對照組大鼠腎和脊髓的p22phox為陰性表達，鏡下細胞膜上罕見棕色線條或顆粒，無棕色線圈；糖尿病組為強陽性表達，鏡下隨處可見有棕黃色顆粒、線圈或線條，色彩明顯。干預(yù)組為弱陽性表達，鏡下散在分布棕黃色顆?；蚓€條，色彩較淡。因此可知p22phox在正常大鼠的腎和脊髓細胞中表達水平很低，當大鼠患糖尿病后，高血糖啟動氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)p22phox大量產(chǎn)生，使用Tempol干預(yù)，p22phox為弱陽性表達，說明tempol可以抑制DM大鼠p22phox的生成。結(jié)果見圖1～圖2。

圖1 大鼠腎臟p22phox的表達

圖2 大鼠脊髓p22phox的表達

表1 各組大鼠腎和脊髓陽性細胞百分率的比較 （±s）

表1 各組大鼠腎和脊髓陽性細胞百分率的比較 （±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05；與糖尿病組相比，2）P＜0.05

?組別 n 腎陽性細胞百分率（%）脊髓陽性細胞百分率（%）正常對照組 6 0.50±0.55 0.50±0.55糖尿病組 6 20.67±3.881） 28.33±3.831）干預(yù)組 6 5.33±1.751）2） 7.34±3.331）2）F 108.26 145.47 P＜ 0.05 ＜ 0.05

3 討論

糖尿病時腎組織和脊髓氧化應(yīng)激損傷發(fā)生的途徑眾多，其中高糖是最主要的誘因，誘導(dǎo)細胞生成ROS，ROS激活細胞內(nèi)的蛋白激酶C、蛋白激酶使轉(zhuǎn)錄因子核因子κb及活化蛋白－1活化，啟動細胞因子及生長因子的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及病情進展［5]。

進入胞內(nèi)的葡萄糖怎樣誘發(fā)ROS的原因目前還不清楚。但已知ROS主要來自于NADPH氧化酶，NADPH 氧化酶由 p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox等亞基組成，前兩種在細胞膜表達，后兩種在細胞漿表達。不同器官NADPH氧化酶的構(gòu)成不同，腎臟和脊髓細胞含有p22phox、p47phox和p67phox。NADPH氧化酶調(diào)控腎臟和脊髓細胞ROS的生成增多，誘發(fā)氧化應(yīng)激，參與DM并發(fā)癥發(fā)生［6]。氧化反應(yīng)會引起機體的應(yīng)激調(diào)節(jié)，最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)方式就是交感神經(jīng)興奮，他們有著緊密關(guān)聯(lián)［7]。由于交感神經(jīng)發(fā)自脊髓，可能在脊髓有NADPH氧化酶表達，因此取脊髓交感神經(jīng)傳出部位實驗。

DM大鼠腎臟p22phox表達強陽性，提示NADPH氧化酶的增多，ROS氧化應(yīng)激增強；脊髓的p22phox的表達增加，表示DM大鼠脊髓NADPH氧化酶含量增多，氧化能力增強。可外周組織和中樞神經(jīng)的氧化應(yīng)激具體有何種關(guān)聯(lián)還有待下一步研究。Tempol是ROS的清除劑，通過抑制自由基的產(chǎn)生，增強機體的抗氧化能力來減少氧化損傷。干預(yù)組大鼠腎臟和脊髓的p22phox表達降低，提示Tempol能使DM大鼠腎和脊髓的p22phox表達降低，減輕氧化應(yīng)激對腎組織和脊髓的損傷，有一定的保護作用，它不僅是ROS的清除劑，而且對NADPH氧化酶也有一定的抑制作用。