陳偉棟，張燕敏，熊飛，曹秋實(shí)，劉晶

(1.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430022；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430061)

腎結(jié)石是慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎衰竭的重要危險(xiǎn)因素[1]。尿路結(jié)石約80%為草酸鈣結(jié)石，其他還有尿酸鈣、磷酸鈣等成分[2]。目前普遍認(rèn)為腎結(jié)石的形成與尿液中晶體過飽和、尿路通暢性及黏膜表面性狀發(fā)生改變等有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞膜的氧化炎癥損傷與結(jié)石的形成密切相關(guān)[4]，腎結(jié)石引起患者體內(nèi)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激與炎癥因子的產(chǎn)生造成腎小管上皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)石形成[5]。p47phox作為煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化酶發(fā)揮活性的關(guān)鍵部位的亞基，是反應(yīng)性氧族生成的主要來源，能產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥因子。TGF-β1、IL-6作為炎癥因子，能介導(dǎo)多種信號(hào)通路，激活下游信號(hào)分子，激活特異性信號(hào)通路。排石沖劑治療尿路結(jié)石有30多年的歷史，治療尿路結(jié)石總有效率達(dá)86%，療效顯著[6]，具體作用機(jī)制有待于深入研究。本實(shí)驗(yàn)建立草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型，通過不同濃度的排石沖劑進(jìn)行干預(yù)，觀察p47phox、TGF-β1、IL-6 mRNA蛋白在腎臟的表達(dá)，進(jìn)一步探討排石沖劑治療草酸鈣結(jié)石的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠60只，10～12周齡，清潔級(jí)，體質(zhì)量(200±25)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào)：4200060001665。于武漢東湖學(xué)院動(dòng)物房喂養(yǎng)。

1.2藥品與試劑

1.2.1藥物 排石沖劑組成：金錢草30 g、海金沙15 g、雞內(nèi)金15 g、石韋20 g、王不留行子15 g、滑石15 g、生牡蠣10 g、冬葵子15 g、川楝子15 g、白芍15 g、甘草5 g。由湖北省中醫(yī)院制劑中心提供(鄂藥制字Z20150023)，顆粒劑，規(guī)格每袋10 g。

1.2.2試劑 乙二醇(湖北廣達(dá)化工有限公司，批號(hào)：20160411)；氯化銨(湖北廣達(dá)化工有限公司，批號(hào)：20160218)；枸櫞酸鉀(湖北廣達(dá)化工有限公司，批號(hào)：20160106)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，批號(hào)：639505)；三氯甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10006818)；甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10010018)；蘇木精(Bioswamp公司，批號(hào)：PAB180015)；中性樹脂(Bioswamp公司，批號(hào)：PAB180017)。

1.3儀器與設(shè)備 正置顯微鏡(OLYMPUS公司，CX41)；移液器(吉爾森P型移液器公司，P10、P100、P200、P1000)；恒溫烘箱(上海恒科學(xué)儀器有限公司，DHG-9023A)；組織脫水機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司，TKD-TSB)；石蠟包埋機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司，TB-718D)；石蠟切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，RM2235)；攤片烤片機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司，TKD-TK)；SYBR Green PCR(KAPA Biosystems公司，貨號(hào)：KM4101)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(BIO-RAD公司，型號(hào)：T100-Thermal Cycler)；熒光定量PCR儀(Real-Time System公司，BIO-RAD)。

1.4動(dòng)物分組、模型制備、給藥方法

1.4.1動(dòng)物分組 大鼠正常飼料、飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后，按隨機(jī)抽樣的方法分為6組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、枸櫞酸鉀組和排石沖劑小、中、大劑量組，每組各10 只。所有大鼠均在空調(diào)恒溫 25 ℃環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.4.2模型制備 草酸鈣結(jié)石大鼠模型的經(jīng)典造模方法[7-8]：以 1%乙二醇自由飲水和 2%氯化銨溶液灌胃1 mL·(100 g)-1作為草酸鈣結(jié)石的造模方法。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為：腎組織中可見草酸鈣結(jié)晶沉積。

1.4.3給藥方法 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組：給予0.9%氯化鈉溶液1 mL·(100 g)-1灌胃。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》按照體表面積折算大鼠給藥劑量，排石沖劑給藥量為1 mL·(100 g)-1，藥物濃度為：小劑量組1.2 g·mL-1，中劑量組2.4 g·mL-1，大劑量組3.6 g·mL-1，分別相當(dāng)于成人臨床等效劑量的 1，2，3 倍。枸櫞酸鉀組：給予 25%枸櫞酸鉀溶液1 mL·(100 g)-1灌胃。實(shí)驗(yàn)周期為28 d。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1大鼠尿草酸、尿鈣的含量 實(shí)驗(yàn)第28天將大鼠置于代謝籠收集24 h尿液，記錄24 h尿量。自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)尿液中鈣離子(Ca2+)含量，尿草酸含量測(cè)定采用高效液相色譜法。

1.5.2腎臟組織形態(tài)學(xué)變化 實(shí)驗(yàn)第28天，摘取大鼠腎臟，將所取組織在10%甲醛溶液中固定1～2 d，按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋、切片、烤片。通過Vonkossa染色，觀察腎臟結(jié)晶沉淀及腎臟病理學(xué)改變。

1.5.3腎組織草酸鈣結(jié)晶的量化評(píng)分 從Vonkossa染色的病理切片中，隨機(jī)選取每只大鼠的2張病理切片，在一張切片中隨機(jī)選擇3個(gè)視野觀察草酸鈣結(jié)晶，取3個(gè)視野觀察的分值的平均值作為該片的結(jié)晶量化分值。量化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)采用形態(tài)分級(jí)評(píng)分法[9]：腎組織中無結(jié)晶計(jì)0分；腎組織中有少許散在的結(jié)晶亮點(diǎn)計(jì)1分；廣泛的腎組織局限性結(jié)晶計(jì)2分；腎組織中有堆積結(jié)晶，散在分布不連接的計(jì)3分；腎組織中鈣鹽結(jié)晶堆積且互相連接計(jì)4分；腎組織中廣泛成堆結(jié)晶，連接成片計(jì)5分。

1.5.4RT-PCR檢測(cè)腎組織中p47phox 、TGF-β1、IL-6 mRNA表達(dá)水平 腎組織總RNA的提取，RNA中基因組DNA 消除并除去DNase1后，按以下體系加入引物，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加入引物，引物信息如下：TGF-β1-F，序列ATTCCTGGCGTTACCTT，TGF-β1-R 序列AGCCCTGTATTCCGTCT，擴(kuò)增片段大小96 bp；p47phox-F，序列TCCCTGCATCCTATTTGGAG，p47phox-R，序列GGGACACCTCATCCTCTTCA，擴(kuò)增片段大小126 bp；IL-6-F，序列TTGCCTTCTTG-GGACTGATGT，IL-6-R，序列TACTGGTCTGTTGT-GGGTGGT；GAPDH-F，序列CAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH-R，序列CCAGTA-GACTCCACGACAT，擴(kuò)增片段大小138 bp。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠尿草酸、尿鈣含量比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和排石沖劑小、中、大劑量組大鼠尿草酸、尿鈣含量均顯著升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，排石沖劑小劑量組無明顯差異(P>0.05)，排石沖劑中劑量組尿草酸顯著降低(P<0.05)，排石沖劑大劑量組和枸櫞酸鉀組的尿草酸顯著降低(P<0.01)，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 6組大鼠尿草酸和尿鈣含量比較Tab.1 Comparison of urinary oxalic acid and urinary calcium among six groups of rats

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05。
Compared with normal control group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05.

2.2光鏡下Vonkossa 鈣結(jié)節(jié)染色 正常對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)排列整齊，腎小球、腎小管等形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎組織中未見草酸鈣結(jié)晶形成及病理學(xué)改變；模型對(duì)照組腎組織中可見大量的黑色鈣結(jié)晶沉積，主要位于在腎小管等部位，部分結(jié)晶融合成堆，腎小管排列不規(guī)則，管腔有狹窄；排石沖劑小、中劑量組腎組織中可見散在分布的鈣結(jié)晶，腎小管管腔擴(kuò)展，腎間質(zhì)水腫。排石沖劑大劑量組和枸櫞酸鉀組腎組織結(jié)構(gòu)接近正常，未見明顯結(jié)晶沉積(圖1)。

2.3各組大鼠腎組織中結(jié)晶形成積分 見圖2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、排石沖劑小劑量組的結(jié)晶評(píng)分顯著升高(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，排石沖劑大劑量組、枸櫞酸鉀組評(píng)分顯著降低(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，排石沖劑中劑量組也顯著降低(P<0.05)。

2.4大鼠腎組織中p47phox 、TGF-β1、IL-6 mRNA表達(dá)比較 RT-PCR顯示，p47phox 、TGF-β1、IL-6 mRNA在正常對(duì)照組大鼠腎組織中有表達(dá)，模型對(duì)照組中表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，排石沖劑小、中劑量組中p47phox 、TGF-β1、IL-6 mRNA的表達(dá)比正常對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.01)，但與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，排石沖劑大劑量組、枸櫞酸鉀組大鼠腎組織中p47phox、TGF-β1、IL-6 mRNA的表達(dá)較模型對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。排石沖劑大劑量組和枸櫞酸鉀組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.排石沖劑小劑量組；D.排石沖劑中劑量組；E.排石沖劑大劑量組；F.枸櫞酸鉀組。與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與模型對(duì)照組比較，*3P<0.05，*4P<0.01。圖2 6組大鼠腎組織中結(jié)晶形成積分比較A.normal control group ;B.model control group;C.low-dose Paishi granule group;D.medium-dose Paishi granule group;E.high-dose Paishi granule group;F.potassium citrate group.Compared with normal control group,*1P<0.01，*2P<0.05;Compared with model control group,*3P<0.05，*4P<0.01.Fig.2 Comparison of crystallization integral in kidneys among six groups of

表2 6組大鼠腎組織中TGF-β1、p47phox、IL-6 mRNA表達(dá)情況Tab.2 The mRNA expression of TGF-β1,p47phox and IL-6 mRNA in kidneys of six groups of rats

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與模型對(duì)照組比較，*3P<0.05。
Compared with normal control group,*1P<0.01，*2P<0.05;Compared with model control group,*3P<0.05.

3 討論

腎結(jié)石發(fā)病率逐年上升，全世界腎結(jié)石發(fā)病率平均約為10.0%[10]。腎結(jié)石病因尚不清楚，目前多數(shù)認(rèn)為其可能與遺傳、代謝、氣候等多種因素有關(guān)[11]，近年來發(fā)現(xiàn)結(jié)石形成的主要病理機(jī)制是腎小管上皮細(xì)胞的損傷，可能是導(dǎo)致結(jié)石形成的起始因素[12]。草酸鈣腎結(jié)石的發(fā)生與腎小管上皮細(xì)胞的氧化炎癥的損傷密切相關(guān)，氧化炎癥導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞膜損傷，線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，空泡形成，細(xì)胞膜微絨毛減少，并產(chǎn)生炎癥因子，腎小管上皮細(xì)胞膜損傷后導(dǎo)致細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)和功能的破壞，有利于結(jié)石的黏附[13]。腎小管上皮細(xì)胞損傷與草酸鈣晶體的沉積有關(guān)，氧自由基是導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞膜損傷的主要因素。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase，NOX)是將來自于細(xì)胞內(nèi)NADPH 的電子傳遞給氧分子以生成活性氧的一組跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[14]。NADPH氧化酶是組織細(xì)胞中反應(yīng)性氧族產(chǎn)生的主要調(diào)控酶，是病變組織活性氧生成的主要來源[15]。已在多種類型的腎臟疾病動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn) NADPH 氧化酶參與腎臟的氧化應(yīng)激損傷，抑制NADPH 氧化酶的表達(dá)和活性可減輕腎臟的氧化應(yīng)激損傷[16]。NADPH氧化酶發(fā)揮活性的關(guān)鍵部位在亞基p47phox，NADPH 作為電子供體，通過p47phox 的磷酸化與p67phox的移位，再與另外亞基gp91phox 和 p22phox聚集而活化，將氧轉(zhuǎn)化為 O2-，產(chǎn)生反應(yīng)性氧族，導(dǎo)致對(duì)機(jī)體的損傷。

TGF-β1、IL-6是比較常見的炎癥因子，腎結(jié)石大鼠模型尿液中這些炎癥因子表達(dá)明顯增加[17]。TGF-β1、IL-6作為炎癥因子，能介導(dǎo)p38MAPK等信號(hào)通路，激活下游信號(hào)分子，參與腎小管細(xì)胞膜的損傷，促進(jìn)草酸鈣結(jié)石的形成。

腎結(jié)石屬于祖國醫(yī)學(xué)“腰痛、石淋”等范疇，病因主要為濕熱蘊(yùn)結(jié)。排石沖劑是湖北省中醫(yī)院巴元明教授根據(jù)全國名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承指導(dǎo)教師邵朝弟教授治療尿路結(jié)石三十多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，運(yùn)用“病證結(jié)合”的研究思路，以清熱、利濕、活血為治法，精選方藥，配伍而成。方選金錢草為君，以利尿通淋，清利濕熱；以海金沙、雞內(nèi)金、牡蠣為臣，以通淋化石，軟堅(jiān)散結(jié)；以王不留行子、川楝子、白芍、滑石、冬葵子、石韋為佐，其中川楝子、王不留行子、白芍可行氣化瘀；以甘草為使，調(diào)和諸藥。全方功效：清利熱濕、理氣化瘀、排石通淋。前期研究表明：排石沖劑可降低尿草酸、血Ca2+等促腎結(jié)石形成物質(zhì)的水平，促進(jìn)腎結(jié)石溶解，明顯抑制尿中和腎組織中草酸鈣晶體的形成及減輕腎功能損傷程度，保護(hù)腎臟，在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)[18-19]，應(yīng)用不同濃度的排石沖劑含藥血清進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)排石沖劑對(duì)草酸和草酸鈣晶體誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞緊密連接蛋白改變具有恢復(fù)作用，減少草酸鈣晶體的黏附，抑制了草酸鈣結(jié)石的形成，而且其作用的效果與排石沖劑的濃度成正比。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)草酸鈣結(jié)石模型對(duì)照組p47phox表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明草酸鈣結(jié)石形成過程中NADPH氧化酶被激活，同時(shí)模型對(duì)照組TGF-β1、IL-6 mRNA的水平較正常對(duì)照組也顯著增強(qiáng)，提示草酸鈣結(jié)石形成過程中產(chǎn)生炎癥、氧化過程。筆者采用排石沖劑進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)排石沖劑大劑量組與模型對(duì)照組比較，p47phox、TGF-β1、IL-6 mRNA的水平顯著下降，與枸櫞酸鉀治療水平相當(dāng)，提示排石沖劑有抗炎、抗氧化應(yīng)激作用。排石沖劑有降低p47phox、TGF-β1、IL-6 mRNA的水平的作用，而且隨著排石沖劑的濃度增加而表現(xiàn)出更好的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)揭示了在草酸鈣結(jié)石形成過程中，腎小管上皮細(xì)胞的損傷產(chǎn)生TGF-β1、IL-6等炎癥因子，活性氧、炎癥因子的產(chǎn)生可能通過NADPH氧化酶所介導(dǎo)。大劑量排石沖劑可以抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化炎癥反應(yīng)，抑制草酸鈣腎結(jié)石的形成。