谷會(huì)青，張洪平，侯亞申，伊合帕爾·吐依洪

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院呼吸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 神香草于2014年7月采自新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰市小東溝，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部趙翡翠主任中藥師鑒定為硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss)的全草。阿司匹林腸溶片(Bayer Health Care Manufacturing S.r.l，批號(hào)：BJ32094)，MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170418)，二甲苯(天津市百世化工有限公司，批號(hào)：20160412)，N-萘乙胺鹽酸鹽[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：N9125-10G]，無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：SLBC0284V]，青霉素鈉(北京悅康凱悅制藥有限公司，批號(hào)：06160116)，氫氧化鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20091017)，甲醇(天津市百世化工有限公司，批號(hào)：20161202)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠50只，體質(zhì)量 18～22 g，雌雄各半，清潔級(jí)，購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(新)2016-002；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：65000200001137。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃、相對(duì)濕度60%～65%、12 h明暗交替環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食飲水。

1.3HEO的制備 參考文獻(xiàn)[12]，采用干燥的神香草，全草切成細(xì)段，按《中華人民共和國(guó)藥典》(第四部，2015年版)2204項(xiàng)下?lián)]發(fā)油測(cè)定法甲提取揮發(fā)油，稱取藥材，收集揮發(fā)油用無(wú)水硫酸鈉除水，揮發(fā)油得率為0.18%，放在干燥遮光玻璃瓶里用封口膜密封，4 ℃保存。

1.4HEO對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 昆明種小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成4組：模型對(duì)照組 (0.9%氯化鈉溶液)、阿司匹林組 (200 mg·kg-1)、HEO大劑量組(0.4 mL·kg-1)、HEO小劑量組(0.2 mL·kg-1)，每組10只；灌胃給藥 每天1次，連續(xù) 7 d，灌胃體積均為0.02 mL·g-1，末次給藥后 30 min，各組小鼠均在小鼠右耳前、后面均勻涂二甲苯50 μL致炎，1 h后取血，將收集血液放在EP管中3500 r·min-1離心10 min(r=15 cm)，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)EP管放在-85 ℃冰箱備用。沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑9 mm打孔器分別在兩耳的同一部位打下圓耳片，精密稱質(zhì)量，以左、右耳質(zhì)量差為腫脹度，以此判斷HEO對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響；耳腫脹度 (mg)=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量；腫脹抑制率 (%)= [(模型對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型對(duì)照組平均腫脹度]×100%[13]。

1.5硫代巴比妥酸(TBA)法對(duì)小鼠血清中MDA含量進(jìn)行檢測(cè) 將實(shí)驗(yàn)小鼠處死取血后，經(jīng)離心機(jī)離心后得到血清樣本。按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)各個(gè)試劑進(jìn)行處理后得到試劑一、試劑二應(yīng)用液、試劑三應(yīng)用液，再按照操作步驟在空白管先后分別加入0.1 mL無(wú)水乙醇和試劑一、1.5 mL試劑二和試劑三應(yīng)用液；在標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)品(四乙氧基丙烷)代替空白管的無(wú)水乙醇，其他試劑與空白管相同；測(cè)定管中加入0.1 mL測(cè)試樣品代替標(biāo)準(zhǔn)管中的標(biāo)準(zhǔn)品，其他試劑與標(biāo)準(zhǔn)管中的試劑相同。旋渦混勻后，用保鮮膜將試劑管扎緊再刺一小洞，95 ℃水浴40 min，用冷水冷卻后3500 r·min-1離心10 min(r=15 cm)，取上清液約0.8 mL在532 nm處測(cè)吸光度(A值)。計(jì)算公式：血清中MDA含量(nmol·mL-1)=(測(cè)定A值-空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol·mL-1)×樣品稀釋前的稀釋倍數(shù)[14]。

1.6Griess法檢測(cè)小鼠血清中NO含量 將實(shí)驗(yàn)小鼠處死取血后，經(jīng)離心機(jī)離心后得到血清樣本[15]。然后按照相關(guān)資料分別配制正確的試劑，10 mmol·mL-1亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，試劑A(用85%濃磷酸0.6 mL、去離子水7 mL、與無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸0.1 g進(jìn)行混勻，最后定容至10 mL)試劑B(N-1-萘乙二胺鹽0.01 g，酸鹽用去離子水定容至10 mL)。按照操作步驟分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋(稀釋濃度分別是6.250，3.125，1.560，0.780，0.390和0.295 μmol·mL-1)，加樣，分別加入試劑A與試劑B，最后在540 nm波長(zhǎng)檢測(cè)A值。以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品A值與標(biāo)準(zhǔn)物濃度求出直線回歸方程，NaNO2含量計(jì)算公式X=0.932 3Y-0.535 4，R2=0.998 6。計(jì)算樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為實(shí)際樣品濃度。

1.7紫外分光光度法檢測(cè)小鼠血清中PGE2含量 將實(shí)驗(yàn)小鼠處死取血后，經(jīng)離心機(jī)離心后得到血清樣本。然后按照相關(guān)資料分別配制正確的試劑，0.5 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液。取小鼠血清0.5 mL，然后加入0.5 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液1 mL，混勻后50 ℃水浴異構(gòu)化20 min，取出稍冷卻后2000 r·min-1離心3 min(r=15 cm)，取上清液，紫外分光光度計(jì)278 nm處測(cè)定吸光度值[16]。由于小鼠灌胃操作失誤及部分小鼠采血量較少造成樣本量有所減少。

2 結(jié)果

2.1HEO對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 致炎后各組小鼠右耳立刻出現(xiàn)明顯紅腫現(xiàn)象，阿司匹林組、HEO大劑量組與小劑量組與模型對(duì)照組比較都有很明顯的抗炎作用，HEO大劑量組平均腫脹抑制率為57.96%；HEO在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)可明顯降低二甲苯致小鼠的耳廓腫脹度 (P<0.01)。見圖1。

A.模型對(duì)照組；B.阿司匹林組；C.HEO大劑量組；D.HEO小劑量組；與模型對(duì)照組比較，*1P<0.01。圖1 4組小鼠耳腫脹度比較A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.01.Fig.1 Comparison of ear swelling among four groups of

2.2HEO對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型小鼠血清MDA含量的影響 與模型對(duì)照組比較，阿司匹林組和HEO大劑量組、小劑量組的MDA含量明顯降低，藥物處理組與模型對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，HEO大、小劑量組與阿司匹林組差異不明顯(P>0.05)。HEO可降低急性炎癥模型小鼠血清中的MDA含量，見圖2。

2.4HEO對(duì)急性炎癥模型大鼠血清PGE2含量的影響 與模型對(duì)照組比較，HEO大、小劑量組與阿司匹林組小鼠血清PGE2含量均明顯降低(P<0.05)，見圖4。

A.模型對(duì)照組；B.阿司匹林組；C.HEO大劑量組；D.HEO小劑量組；與模型對(duì)照組比較，*1P<0.01。圖2 4組小鼠血清中MDA含量比較A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.01.Fig.2 Comparison of serum MDA content among four groups of

A.模型對(duì)照組；B.阿司匹林組；C.HEO大劑量組；D.HEO小劑量組；與模型對(duì)照組比較，*1P<0.05。圖3 4組小鼠血清中NO含量比較A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.05.Fig.3 Comparison of serum NO content among four groups of

3 討論

炎癥是具有血管系統(tǒng)的組織對(duì)致炎因子的侵入所發(fā)生的防御反應(yīng)，在一般的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，由于炎癥遞質(zhì)的刺激，血管通透性增加引起血管內(nèi)容物滲入到組織間隙，以毛細(xì)血管擴(kuò)張和通透性增高、滲出和組織腫脹主；隨之白細(xì)胞從血液滲透到組織間隙，以白細(xì)胞聚集為主；最后是肉芽腫的形成、纖維組織增生等[17-19]。

本實(shí)驗(yàn)在前期HEO藥效學(xué)研究的基礎(chǔ)上[20]，通過(guò)急性炎癥模型對(duì)HEO的抗炎效果做進(jìn)一步的藥理學(xué)研究。結(jié)果顯示，HEO處理可抑制急性炎癥小鼠耳腫脹。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中的代謝產(chǎn)物之一，其水平可反映機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映細(xì)胞的損傷情況[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HEO可降低耳腫脹小鼠血清MDA的含量，因此推測(cè)HEO對(duì)小鼠耳腫脹的抑制作用可能與降低小鼠血清MDA的含量，抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

A.模型對(duì)照組；B.阿司匹林組；C.HEO大劑量組；D.HEO小劑量組；與模型對(duì)照組比較，*1P<0.05。圖4 4組小鼠血清中PGE2含量比較A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.05.Fig.4 Comparison of serum PGE2 content among four groups of

在炎癥部位，NO作用于血管平滑肌細(xì)胞，升高其cGMP水平，使血管舒張，通透性增高，以利于炎癥遞質(zhì)和致痛物質(zhì)到達(dá)作用部位，在炎癥反應(yīng)中促進(jìn)單核細(xì)胞向炎癥部位滲入[22]。PGE2是一種重要的促炎癥因子，是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種非蛋白、非多肽的脂肪酸代謝產(chǎn)物[23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HEO可降低耳腫脹度，同時(shí)也可降低小鼠血清NO和PGE2的含量，由此推斷HEO的抗炎作用可能與HEO降低組織內(nèi)NO和PGE2的含量有關(guān)。

綜上所述，HEO對(duì)二甲苯致急性炎癥具有一定的抑制作用，其作用機(jī)制可能與降低NO和MDA含量，抑制炎癥因子PGE2表達(dá)有關(guān)，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。