黃徐英，宋紅萍，柳鑫，屠寒，陳玲

(武漢市第四醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430034)

筒鞘蛇菰(BalanophorainvolucrataHo ok.f.)又名鹿仙草，為蛇菰科蛇菰屬草本寄生植物[1]。筒鞘蛇菰是湖北省西北武當(dāng)山、神農(nóng)架林區(qū)具有地方特色的民間草藥。其氣味甘苦，無毒，具有涼血止血、鎮(zhèn)痛和生肌作用。在民間常用于治療各類出血癥，功效奇佳[2-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，筒鞘蛇菰乙酸乙酯部位可顯著縮短小鼠出血時間和凝血時間，為止血作用的主要活性部位[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)以乙酸乙酯部位為研究對象，探討其止血作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，鼠齡3個月，體質(zhì)量160～200 g，動物質(zhì)量合格證號：42000600025169，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(鄂)2017-0065。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24 ℃，相對濕度為40%～60%。

1.2藥品與試劑 筒鞘蛇菰(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，批號：20161201)，經(jīng)武漢市第四醫(yī)院陳貴生主任中藥師鑒定為蛇菰屬植物筒鞘蛇菰；云南白藥(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號：ZCB1708)；石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、氯化鈣、枸櫞酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)，純化水。試劑盒：凝血酶時間(thrombin time,TT，批號：46951)、凝血酶原時間(prothrombin time,PT，批號：546986)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT，批號：557232A)，纖維蛋白原(fibrinogen,FIB，批號：547511)，均為Siemens公司生產(chǎn)。血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：AK0017JUL25002)；6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：AK0017JUL23001)。

1.3儀器 FW177中藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；98-1-B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HH-SH數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州莆田儀器制造公司)；ALC-210.2電子天平(北京塞多利斯天平有限公司，d=0.01 g)；DZF-6030真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司，r=62.2 mm)；CS-2000i全自動凝血分析儀(日本希森美康株式會社)；DR-200Bs酶標(biāo)儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)。

1.4方法

1.4.1樣品溶液的制備 取筒鞘蛇菰粗粉(過孔徑700 μm篩)，用95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，趁熱過濾，減壓回收溶劑，得濃縮液，進(jìn)一步水浴揮至無醇味，靜置，冷卻。加適量水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯萃取液減壓回收溶劑，真空干燥(60 ℃)，粉碎成粉，即制成乙酸乙酯萃取物(計算平均得率為11.6%)。臨用前，用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成適宜濃度的混懸液。

1.4.2大鼠血漿復(fù)鈣時間(plasma recalcification time,PRT)的測定 取SPF級Wistar大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對照組(灌胃給予0.5%CMC-Na溶液)、云南白藥組(即陽性對照組，0．33 g·kg-1)、筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物(小、中、大劑量組：0.29，0.58和1.16 g·kg-1)，每天給藥1次，連續(xù)5 d。于末次用藥后1 h，頸動脈插管取血，加入裝有3.8%枸櫞酸鈉溶液的離心管內(nèi)抗凝(血液與3.8%枸櫞酸鈉之比為9：1)，以1500×g，離心10 min，分離血漿備用。

取試管加入血漿0.1 mL，放入37 ℃水浴中溫育1 min，然后各加入0.28%氯化鈣溶液0.1 mL?；靹蚝笤俜湃?7 ℃水浴中，同時開始計時。30 s后每隔10 s緩慢傾斜試管1次。記錄自加Ca2+至纖維蛋白形成，液面不動所需時間，即為該供試品組大鼠PRT。

1.4.3大鼠TT、PT、APTT、FIB的測定 分別取“1.4.2”項(xiàng)中血漿。嚴(yán)格按各指標(biāo)試劑盒的要求進(jìn)行TT、PT、APTT、FIB 的測定。

1.4.4大鼠TXB2和6-keto-PGF1α測定 分別取“1.4.2”項(xiàng)中血漿。嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作，采用酶聯(lián)免疫法檢測TXB2和6-keto-PGF1α。

2 結(jié)果

2.1對大鼠血漿PRT的影響 空白對照組、云南白藥組和乙酸乙酯萃取物小、中、大劑量組PRT分別為(117.73±16.73)，(78.73±15.17)，(86.69±14.45)，(73.77±16.14)和(60.39±17.70)s。與空白對照組比較，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物小、中、大劑量組均可顯著縮短大鼠血漿復(fù)鈣時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

2.2對大鼠TT、PT、APTT、FIB的影響 與空白對照組比較，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物大、中劑量組大鼠TT、PT、APTT均縮短，大鼠FIB的含量均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物小劑量組大鼠TT、PT、APTT縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，但FIB的含量變化不顯著。結(jié)果見表1。

表1 5組大鼠TT、PT、APTT、FIB比較Tab.1 Comparison of TT，PT，APTT and FIB among five groups of rats

與空白對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01。
Compared with blank control group，*1P<0.05，*2P<0.01.

2.3對大鼠TXB2和6-keto-PGF1α的影響 與空白對照組比較，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物大、中、小劑量組大鼠體內(nèi)TXB2均上升，6-keto-PGF1α的含量均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，同時TXB2/6-keto-PGF1α比值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 5組大鼠TXB2和6-keto-PGF1α比較Tab.2 Comparison of TXB2 and 6-keto-PGF1α among five groups of rats

與空白對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05。
Compared with blank control group，*1P<0.01，*2P<0.05.

3 討論

凝血過程是由一系列凝血因子參與的酶促反應(yīng)。經(jīng)典的凝血瀑布學(xué)說認(rèn)為凝血由內(nèi)源性途徑、外源性途徑和共同通路組成[5-6]。本實(shí)驗(yàn)考察了筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物對大鼠PRT以及凝血功能指標(biāo)PT、TT、APTT、FIB 的影響，結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取物可同時縮短大鼠PRT、PT、TT、APTT，增加大鼠FIB，有顯著的止血作用，具有激活內(nèi)源性、外源性凝血途徑中的多種凝血因子，促進(jìn)凝血酶原和凝血活酶生成、提高FIB的含量、加速纖維蛋白合成的作用。

血小板活化是血小板聚集的啟動環(huán)節(jié)。在血小板聚集中有一對精巧的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，即血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)和前列環(huán)素(epoprostenol,PGI2)。TXA2是目前已發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)收縮血管物質(zhì)與血小板聚集劑之一。PGI2則是較強(qiáng)的血小板聚集抑制劑，具有抑制血小板的粘附、聚集和釋放反應(yīng)，抑制血小板的促凝活性等作用[7]。

PGI2和TXA2之間的動態(tài)平衡是維持正常止血功能的基礎(chǔ)。但是由于TXA2和PGI2的半衰期很短，一般將TXA2和PGI2穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和6-keto-PGF1α作為判斷其濃度的指標(biāo)[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物能提高大鼠TXB2和下調(diào)6-keto-PGF1α的含量，增加TXB2/6-keto-PGF1α比值。因此，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物可能是通過對TXB2及6-keto-PGF1α含量的影響，增強(qiáng)血小板的聚集功能，從而加速血小板內(nèi)部促凝物的釋放，加速凝血。

筒鞘蛇菰屬涼血止血藥，本實(shí)驗(yàn)藥理研究僅停留在其有效部位的研究，未能系統(tǒng)地揭示具體活性成分與止血藥理作用、機(jī)制之間的關(guān)系。大量文獻(xiàn)分析總結(jié)發(fā)現(xiàn)，涼血止血藥大部分含黃酮類成分。潘劍宇等[9]研究筒鞘蛇菰化學(xué)成分時，從筒鞘蛇菰乙酸乙酯提取部位分離得到7種黃酮化合物，因此推斷乙酸乙酯部位止血有效成分可能與黃酮類化合物有關(guān)。為使其質(zhì)量可控，保證臨床療效，還有待于對其黃酮類化合物進(jìn)一步深入研究。