謝伊代·圖爾蓀托合提，唐欲博，曾嘉煒，趙麗巖，陳攀，陳杰，陳孝

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510080)

南蛇藤素(celastrol)，即雷公藤紅素(tripterine)，是從傳統(tǒng)中藥雷公藤(Tripterygiumwilf.i Hook F)根部提取的一種天然五環(huán)三萜類化合物[1]，具有抗炎、抗氧化、抗癌等藥理作用。南蛇藤素為一種蛋白酶抑制劑，能影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種信號通路而發(fā)揮其抗癌作用，如乳腺癌、白血病、骨肉瘤、前列腺癌等[2]。近年來，南蛇藤素抗肺癌研究成為熱點。越來越多的證據(jù)表明南蛇藤素通過各種信號通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖、黏附、遷移及侵襲，并促進凋亡而產(chǎn)生抗肺癌的作用[3-8]。此外，南蛇藤素可增強細(xì)胞毒藥物順鉑對肺癌細(xì)胞的抑制作用[9]，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)和南蛇藤素聯(lián)合治療EGFR T790M突變的非小細(xì)胞肺癌患者可能產(chǎn)生更好的療效[10]。盡管如此，南蛇藤素對肺癌的影響機制尚不完全清楚。研究表明，炎癥小體在肺癌組織高表達，且表達水平在肺腺癌組織中高于鱗癌[11]。NLRP3炎癥小體的激活促進肺癌細(xì)胞的生長和遷移[12-13]。有文獻報道，南蛇藤素可抑制NLRP3炎癥小體的表達[14]，南蛇藤素是否通過抑制肺癌組織中高表達的NLRP3炎癥小體進而發(fā)揮抗肺癌作用尚不清楚，本研究探討南蛇藤素對肺癌細(xì)胞NLRP3炎癥小體的調(diào)控作用及其機制，為南蛇藤素用于肺癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549由ATCC提供；南蛇藤素(含量≥98%，批號：18010335)由上海同田公司提供；低糖達爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco公司產(chǎn)品)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒(批號：041318180516)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)配制試劑盒(批號：122117180528)及電化學(xué)發(fā)光(electrochemilu-minescence，ECL)液(批號：091418181107)(碧云天公司)；兔抗人c-myc、cyclin D3、p21和兔抗人α-tublin 抗體(CST公司)；兔抗人NLRP3抗體(博士德生物有限公司，批號：ZP634BP34 )、兔抗人caspase-1(Abcam公司，批號：GR322290-6)、白細(xì)胞介素(IL)-1β抗體(美國bio生物公司，批號：QM1018011)。四氮唑鹽(microculture tetrozolium，MTS)(Promega公司，批號：0000277301)，Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1噻唑藍(MTT)法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、離心、重懸，制備成為單細(xì)胞懸液。以每孔3000個細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL。37℃、5% 二氧化碳(CO2)條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，實驗組分別加入1，2，4 μmol·L-1南蛇藤素孵育A549細(xì)胞，對照組加入等量不含藥物的培養(yǎng)基，分別于24，48 ，72 h后檢測細(xì)胞存活率。處理結(jié)束后加入MTS (每孔10 μL)，輕搖，37 ℃孵育2 h，然后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm波長處的吸光度。計算各組細(xì)胞增殖抑制率，實驗重復(fù)3次。

1.2.2克隆形成實驗 取處于對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞消化、離心、重懸，制備成單細(xì)胞懸液。按每孔1000個細(xì)胞的密度，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜。分別加入終濃度為1，2，4 μmol·L-1的南蛇藤素并設(shè)計對照組，24 h后更換不含藥培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)2周，當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(>50個細(xì)胞/克隆)，終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗2次，晾干后，結(jié)晶紫染色，計算集落形成率(%)=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.3劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 取處于對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞消化、離心、重懸，制備成單細(xì)胞懸液。將肺癌A549細(xì)胞以每孔5×105個細(xì)胞密度接種于6孔板，過夜培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。用200 μL的槍頭在6孔板內(nèi)均勻劃直線，用PBS洗去脫落細(xì)胞，重復(fù)2次。更換含南蛇藤素濃度分別為1，2，4 μmol·L-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后更換含1%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在0，24 h于顯微鏡下觀察并拍照，通過多點測量劃痕邊緣之間距離，計算平均劃痕愈合率。

1.2.4細(xì)胞侵襲實驗 細(xì)胞處理過程同劃痕實驗，將細(xì)胞以每孔5×105個細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜。分別加入終濃度為1，2，4 μmol·L-1的南蛇藤素，24 h 后胰酶消化、離心、收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔2.5×105個。在Transwell下室加入700 μL含15%FBS的DMEM，上室加入不含血清的DMEM細(xì)胞懸液每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去微孔膜上室的殘余細(xì)胞，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，清洗3次，在倒置顯微鏡下(×100倍)計數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞，每張膜中央和周圍部分隨機選取5個視野，每個視野細(xì)胞計數(shù)3次，求出平均值。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取處于對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞消化、離心、重懸，制備成單細(xì)胞懸液。按每孔5×105個細(xì)胞的密度，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜。分別加入終濃度為1，2，4 μmol·L-1的南蛇藤素，24 h后胰酶消化、離心、收集細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次，用250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度約為 l×106·mL-1。取出100 μL細(xì)胞懸液，依次加入Annexin V-FITC 5 μL和PI溶液10 μL?；靹蚝笫覝乇芄夥跤?5 min。加入PBS 400 μL，混勻后上流式細(xì)胞儀(BD，F(xiàn)ACSCanto Flow Cytometer)檢測分析。

1.2.6蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測實驗 將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)皿(每皿2×107個細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后，用濃度分別為1，2，4 μmol·L-1的南蛇藤素處理24 h，收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%BSA封閉1.5 h，加一抗(按照說明書進行稀釋)，于4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯色和曝光，掃描保存圖像，利用Image J軟件測定目的蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1南蛇藤素對肺癌A549細(xì)胞增殖及體外生長能力的影響 采用MTT法測定細(xì)胞增殖，結(jié)果見圖1。用1，2 和4 μmol·L-1南蛇藤素分別作用于肺癌A549細(xì)胞24 ，48 ，72 h后，不同細(xì)胞組的細(xì)胞增殖活性均低于對照組(P<0.05或P<0.01)，南蛇藤素對肺癌A549細(xì)胞增殖有抑制作用。當(dāng)南蛇藤素濃度和作用時間增加時，對細(xì)胞增殖的抑制作用增強，且呈明顯的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系。而且，南蛇藤素還能抑制A549細(xì)胞的集落形成能力(圖2)，南蛇藤素(1，2，4 μmol·L-1)對肺癌A549細(xì)胞集落形成率分別為9.2%，6.0%，0.0%，顯著低于對照組的15.2%。結(jié)果表明，南蛇藤素抑制了肺癌A549細(xì)胞的增殖及體外生長更新能力。

與對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01。圖1 不同濃度南蛇藤素對肺癌A549細(xì)胞增殖有抑制作用Compared with control group，*1P<0.05，*2P<0.01.Fig.1 Inhibition of celastrol at different concentrations on the proliferation of A549 lung cancer cells lines

2.2南蛇藤素對人肺癌A549細(xì)胞遷移的影響 為了評估細(xì)胞遷移、侵襲是否受南蛇藤素影響，分別用劃痕實驗和transwell小室侵襲實驗檢測細(xì)胞遷移、侵襲。如圖3所示，經(jīng)1，2，4 μmol·L-1南蛇藤素處理后的細(xì)胞傷痕愈合率分別為15.88%，13.36%，2.55%，顯著低于對照組的19.24%(P<0.05)。Transwell侵襲實驗檢測結(jié)果顯示，經(jīng)1，2，4 μmol·L-1南蛇藤素處理的每個視野細(xì)胞遷移數(shù)目分別為(42±15)，(16±10)，(4±3)個，較對照組的(104±37)個顯著降低(P<0.05)，且處理組的遷移細(xì)胞數(shù)目隨南蛇藤素濃度的增高而減少。

A.對照組；B.南蛇藤素1 μmol·L-1組；C.南蛇藤素2 μmol·L-1組；D.南蛇藤素4 μmol·L-1組。圖2 南蛇藤素抑制肺癌A549細(xì)胞克隆集落形成A.control group；B.1 μmol·L-1 celastrol group；C.2 μmol·L-1 celastrol group；D.4 μmol·L-1 celastrol group.Fig.2 Inhibiting effect of celastrol on colony formation of A549 lung cancer cell lines

2.3南蛇藤素可誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡 南蛇藤素(1，2，4 μmol·L-1)處理人肺癌A549細(xì)胞24 h，采用Annexin-V/PI雙染流式定量檢測結(jié)果見圖4。隨著南蛇藤素濃度的增加，肺癌A549細(xì)胞的早期凋亡比例逐漸增加，分別為(12.94±5.41)%，(27.78±3.10)%，(30.62±5.11)%，與對照組(9.28±2.16)%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明南蛇藤素能誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡。

2.4南蛇藤素對c-myc、p21、cyclin D3蛋白表達的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示(圖5)，南蛇藤素處理組的A549細(xì)胞c-myc、cyclin D3的表達明顯減弱，p21的表達明顯增強，且隨著藥物濃度增高，其蛋白表達量逐漸減少。

2.5南蛇藤素對人肺癌A549細(xì)胞炎癥小體表達的影響 為進一步探討炎癥小體在南蛇藤素誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡中的作用機制，采用Western blotting法檢測不同濃度南蛇藤素處理肺癌A549細(xì)胞24 h后炎癥小體NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達。結(jié)果如圖6所示，南蛇藤素能使NLRP3、caspase-1及IL-1β的表達下調(diào)。表明南蛇藤素可能通過調(diào)控NLRP3的表達誘導(dǎo)A549細(xì)胞死亡。

A.對照組；B.南蛇藤素1 μmol·L-1組；C.南蛇藤素2 μmol·L-1組；D.南蛇藤素4 μmol·L-1組；與對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01。圖3 南蛇藤素對肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響A.control group;B.1 μmol·L-1 celastrol group；C.2 μmol·L-1 celastrol group；D.4 μmol·L-1 celastrol group ;Compared with control group，*1P<0.05，*2P<0.01.Fig.3 Effect of celastrol on migration and invasion of A549 lung cancer cells

3 討論

近年來，南蛇藤素作為天然抗癌藥物已受到廣泛關(guān)注，其抗腫瘤的機制是抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，如通過調(diào)節(jié)microRNA-24和microRNA-181b抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖[15]；通過影響核因子-κB信號通路[16]、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT(蛋白激酶B)信號通路[17]抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；通過直接自噬降解EGFR[18]、激活線粒體和Fas/fasl介導(dǎo)的通路[19]誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。

A.對照組；B.南蛇藤素1 μmol·L-1組；C.南蛇藤素2 μmol·L-1組；D.南蛇藤素4 μmol·L-1組；與對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01。圖4 4組肺癌A549細(xì)胞凋亡情況A.control group；B.1 μmol·L-1 celastrol group；C.2 μmol·L-1 celastrol group；D.4 μmol·L-1 celastrol group；Compared with control group，*1P<0.05，*2P<0.01.Fig.4 Apoptosis of four groups of A549 lung cancer cells lines

A.對照組；B.南蛇藤素1 μmol·L-1組；C.南蛇藤素2 μmol·L-1組；D.南蛇藤素4 μmol·L-1組。圖5 南蛇藤素對肺癌A549細(xì)胞中c-myc、p21和cyclin D3表達的影響A.control group；B.1 μmol·L-1 celastrol group；C.2 μmol·L-1 celastrol group；D.4 μmol·L-1 celastrol group.Fig.5 Effect of celastrol on the expression of c-myc，p21 and cyclin D3 in lung cancer A549 cells

A.對照組；B.南蛇藤素1 μmol·L-1組；C.南蛇藤素2 μmol·L-1組；D.南蛇藤素4 μmol·L-1組。圖6 南蛇藤素對肺癌A549細(xì)胞NLRP3、caspase-1和IL-1β表達的影響A.control group；B.1 μmol·L-1 celastrol group；C.2 μmol·L-1 celastrol group；D.4 μmol·L-1 celastrol group.Fig.6 Effect of celastrol on the expression of NLRP3，caspase-1 and IL-1β in A549 lung cancer cells lines

炎癥反應(yīng)是多種疾病的基礎(chǔ)病理學(xué)改變，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要標(biāo)志之一[20]。啟動或參與炎癥反應(yīng)核心環(huán)節(jié)的炎癥小體(inflammasome)在致癌作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。研究最多的炎癥小體NLRP3是由NLRP3、凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白(ASC)和pro-caspase-1組成的細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合物，參與針對病原體的先天性免疫應(yīng)答，并觸發(fā)半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的活化和促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟[22]。NLRP3的激活與膀胱癌[23]、乳腺癌[24]、直腸癌[25]等癌癥的發(fā)生和進展有關(guān)。在肺癌組織中NLRP3、IL-1β、caspase-1的表達高于癌旁正常組織[11]，并促進肺腺癌細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲[13]。本研究觀察到南蛇藤素可以抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移；同時下調(diào)了肺癌A549細(xì)胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達。因此推測南蛇藤素是通過下調(diào)NLRP3的表達抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖及轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白包括c-myc原癌基因、cyclin D3和p21等。c-myc蛋白能夠調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[7]，非小細(xì)胞肺癌組織中c-myc蛋白顯著高于癌旁正常組織[26]。文獻報道，cyclin D3與非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥的生長及進展轉(zhuǎn)移有關(guān)[27-29]。p21是細(xì)胞周期調(diào)控因子，可導(dǎo)致G1期停滯來修復(fù)受損DNA或?qū)е录?xì)胞凋亡。p21的降低可加速肺癌臨床分期進展，增加肺癌侵襲轉(zhuǎn)移概率[30]。本研究中觀察到南蛇藤素能顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞中c-myc、cyclin D3的蛋白表達水平，上調(diào)p21蛋白表達水平，且這種作用與南蛇藤素存在明顯的劑量依賴關(guān)系，與南蛇藤素在軟骨肉瘤[2]、多發(fā)性骨髓瘤[31]研究結(jié)果一致。有文獻報道，炎癥小體的激活能誘導(dǎo)細(xì)胞周期的進展[24]，且在一項淋巴瘤研究[32]中發(fā)現(xiàn)NLRP3可通過上調(diào)c-myc表達而促進淋巴瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。因此，推測南蛇藤素可能通過下調(diào)NLRP3炎癥小體，調(diào)控了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-myc、cyclin D3和p21等的表達。

綜上所述，南蛇藤素能夠抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移，促進其凋亡，在體外顯示出較好的抗腫瘤作用，其作用可能是通過抑制NLRP3炎癥小體，并調(diào)控c-myc、cyclinD3、p21蛋白的表達實現(xiàn)。