鄭帥 劉燕 樸春梅 劉婷婷 王吉靜 王綠婭 杜杰

高血壓是最常見的心血管疾病之一，我國18歲以上人群患病率約為23%[1]；高血壓也是導致中風、心梗、主動脈瘤等諸多心腦血管疾病的重要危險因素[2]。巨噬細胞參與調(diào)節(jié)鈉敏感性的血壓變化[3]，更廣泛參與高血壓狀態(tài)下的心臟、腎臟、腦等靶器官的炎癥反應(yīng)和病理生理改變[4]，但其作用機制尚不完全清楚。一磷酸腺苷激活依賴性蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是調(diào)節(jié)細胞能量代謝和功能的核心激酶，其催化亞單位(α subunit)在巨噬細胞中主要表達為α1型(PRKAA1)。既往報道中，AMPK信號通路能夠抑制巨噬細胞的致炎功能，使之更多的表現(xiàn)為抗炎表型[5]。因此，AMPK可能是介導巨噬細胞對于血壓調(diào)節(jié)和高血壓條件下靶器官損傷的重要調(diào)控分子。故本研究采用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建和培育巨噬細胞特異性敲除AMPKα1基因的小鼠，在此基礎(chǔ)上初步檢測這種敲除對于血壓的影響，為進一步研究巨噬細胞AMPK信號通路在高血壓疾病損傷中的作用和機制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.儀器和試劑 電加熱模塊(美國 Thermo Fisher公司)，凝膠電泳儀、凝膠成像儀、Real-time PCR儀(美國Bio-Rad公司)，核酸熒光定量儀(美國Thermo Fisher-Invitrogen公司)，小動物血壓心電系統(tǒng)(國產(chǎn)森西公司)。他莫昔芬(美國Sigma公司)，鼠尾消化液DirectPCR(美國VIAGEN公司)，蛋白酶K和Taq-Master Mix 2X(康為公司)，TRIzol試劑(美國Thermo Fisher-Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)，SYBR聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)，基因型鑒定和Real-time PCR檢測用的引物對(北京諾賽基因組研究中心有限公司)。

2.實驗動物及分組 AMPKα1-loxP轉(zhuǎn)基因小鼠(AMPKα1fl/wt)，以及集落刺激因子受體的啟動子(colony stimulating factor 1 receptor，Csf1r)驅(qū)動表達雌激素受體-Cre融合蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠(Csf1r-MeriCre-Mer)，均購自美國 Jackson實驗室，均為C57BL/6 J品系背景。兩種小鼠雜交繁育，子代進一步雜交，培育攜帶純合型AMPKα1-loxP和Cre(或不攜帶 Cre)的轉(zhuǎn)基因小鼠(AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre及 AMPKα1fl/fl/WT)。實驗小鼠均飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，恒溫恒濕，12 h明-暗晝夜節(jié)律。本實驗得到北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準。

3.培育條件誘導的組織特異性敲除AMPK的小鼠 將AMPKα1-loxP轉(zhuǎn)基因小鼠相互交配，得到AMPKα1fl/fl轉(zhuǎn)基因小鼠，再與Csf1r-MerCre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，得到AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre轉(zhuǎn)基因小鼠，以及AMPKα1fl/fl/WT轉(zhuǎn)基因小鼠，兩種子代小鼠進一步交配，繁育更多具備兩種基因型其中之一的小鼠。對于AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre小鼠，腹腔注射他莫昔芬，激活Cre酶，剪切掉AMPKα1第3外顯子，破壞AMPKα1的基因(Prkaa1)結(jié)構(gòu)，使之無法正常表達。該過程如圖1所示。對照小鼠為AMPKα1fl/fl/WT小鼠。

圖1 轉(zhuǎn)基因小鼠培育過程

4.小鼠基因型的鑒定 將各雜交繁育階段的4周齡子代小鼠，剪取鼠尾末梢組織，用鼠尾消化液：蛋白酶K為100∶1比例的混合液100 μL浸泡，56℃加熱并間斷振搖使鼠尾組織完全消化溶解，之后85℃加熱40 min變性，提取的DNA溶液進一步進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子量大小，從而確定小鼠基因型。用于AMPKα1基因型鑒定的 PCR引物序列為：上游引物5′-CCCACCATCACTCCATCTCT-3′，下游引物 5′-AGCCTGCTTGGCACACTTAT-3′，PCR 條件為：94℃3 min，然后按94℃30秒、62℃30秒、72℃30秒的步驟循環(huán)35次，接72℃2 min，10℃保持。用于MerCre基因型鑒定的PCR引物序列為：上游引物5′-AGATGCCAGGACATCAGGAACCTG-3′，下 游 引 物 5′-ATCAGCCACACCAGACACAGAGATC-3′，PCR 條件為：94℃ 1.5 min，然后按94℃30秒、62℃45秒、72℃45秒的步驟循環(huán)35次，接72℃2 min，10℃保持。

5.他莫昔芬誘導敲除目的基因 給8周齡的小鼠腹腔注射他莫昔芬溶液(濃度為20 mg/mL，溶于食用玉米油)，每天注射1次，每次注射0.1 mL(即2 mg/d)，連續(xù)注射5 d，以誘導Mer-Cre融合蛋白轉(zhuǎn)入細胞核，剪切目標基因的 loxP位點，敲除AMPKα1基因。在開始注射的第6天開展各項實驗檢測。

6.骨髓細胞AMPKα1基因mRNA表達水平的檢測 8周齡的 AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre鼠和AMPKα1fl/fl/WT鼠各取6只，連續(xù)注射他莫昔芬5 d，在第6天將小鼠使用戊巴比妥鈉麻醉處死后，分離右后肢脛骨，剪開兩端，用1 mL注射器灌注0.9%氯化鈉液沖洗骨髓腔，用Ep管收集沖洗下來的細胞懸液，5 000 rpm離心5 min，棄上清，加1 mL的Trizol裂解骨髓細胞，之后用 0.2 mL氯仿抽提RNA，接著用0.5 mL異丙醇沉淀RNA，再用0.5 mL的75%乙醇清洗RNA沉淀兩遍，最后用15 μL的DEPC水溶解RNA。RNA溶液使用Qubit 3 Fluorometer測定濃度，取 2 μg 總量的 RNA，使用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按標準反應(yīng)體系和流程條件反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。各樣本的 cDNA按SYBR(II)PreMix酶20 μL反應(yīng)體系條件進行Realtime PCR檢測，得到的Ct值計算 ΔΔ-Ct，用于統(tǒng)計目標RNA水平的組間差異。AMPKα1的引物序列為： 上游 5′-TACTCAACCGGCAGAAGATTCG-3′， 下游 5′-AGACGGCGGCTTT CCTTTT-3′；內(nèi)參基因 βactin的引物序列為：上游5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游 5′-CCAGT TGGTAACAATGCCAT GT-3′。 Real-time PCR 反應(yīng)條件為：94℃2 min，然后按94℃5秒、60℃34秒、72℃30秒并拍照熒光信號的步驟反應(yīng)40個循環(huán)，最后10℃保持。

7.小鼠血壓的測定 使用國產(chǎn)森西公司的BP2 010 A系統(tǒng)，將未麻醉的小鼠誘導進拘束籠中，留鼠尾在外。拘束籠放在恒溫套管內(nèi)，保證37℃恒溫環(huán)境。將袖套式血壓探頭套在鼠尾根部，固定位置，待小鼠平靜、血壓監(jiān)測曲線穩(wěn)定后，記錄連續(xù)五次測定的血壓值，取平均值作為當次的小鼠血壓。首先取8周齡AMPKα1fl/fl/WT鼠10只，隨機分為兩組，其中一組注射他莫昔芬5 d，第6天檢測兩組血壓。再取 8周齡 AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre鼠 13只，AMPKα1fl/fl/WT鼠10只，均注射他莫昔芬5 d，第6天檢測兩組血壓。

8.統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 5.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，計量資料間兩組均數(shù)比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.巨噬細胞特異性敲除AMPKα1的轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定 剪取4周齡小鼠的鼠尾，提取DNA，對目標片段進行PCR擴增后，跑1%濃度瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。代表性結(jié)果如圖2所示，2 A為對AMPKα1-loxP片段區(qū)域擴增的結(jié)果，野生型AMPKα1該區(qū)域片段為334 bp，而AMPKα1-loxP片段為450 bp，可見樣本1～5均為純合型AMPKα1-loxP陽性轉(zhuǎn)基因鼠(AMPKα1fl/fl)；2B為對 Csf1r-Mer-Cre片段區(qū)域擴增的結(jié)果，該片段為236 bp，可見樣本1、2、5為Cre陽性，而樣本3、4為 Cre陰性。綜合起來，樣本 1、2、5為成功構(gòu)建的 AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre小鼠，而樣本 3、4為 AMPKα1fl/fl/WT對照小鼠。

圖2 轉(zhuǎn)基因小鼠子代基因型鑒定結(jié)果 A：AMPKα1-loxP基因片段的條帶；B：Csf1r-Mer-Cre基因片段的條帶

2.PCR檢測他莫昔芬誘導敲除巨噬細胞AMPK的效果 對 AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre小鼠和AMPKα1fl/fl/WT對照小鼠注射他莫昔芬5 d，提取骨髓細胞RNA，進行Real-time PCR檢測AMPKα1表達水平，結(jié)果如圖3所示，可見相比野生型小鼠，AMPKα1敲除鼠的目標基因RNA水平顯著降低，相對表達量只有野生對照的1/2左右[(0.9263±0.1293)vs.(0.47±0.04657)，P ＜0.01]，證明誘導敲除巨噬細胞中的AMPK是成功的。

圖3 Real-time PCR檢測 AMPKα1基因的表達量(與Cre野生型對照鼠相比，?P＜0.01)

3.檢測敲除巨噬細胞AMPKα1對于小鼠基礎(chǔ)血壓的影響 我們首先檢測了他莫昔芬對于基礎(chǔ)血壓的影響，結(jié)果如圖4 A所示，可見該藥物腹腔注射對基礎(chǔ)收縮壓的影響很小[Cre野生鼠，不注射 vs.注射，收縮壓(122.9±3.183)vs.(124±6.878)mm-Hg，1 mmHg＝0.133 kPa，P＝0.427]，同時兩組小鼠的舒張壓和體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義[不注射 vs.注射，舒張壓(72.48±1.686)vs.(75.86±2.502)mmHg，P＝0.31]；體質(zhì)量[(25.3±1.02)vs.(25±1.19)g，P＞0.999]。 進一步檢測 AMPKα1敲除鼠和野生型對照鼠在注射他莫昔芬5 d之后，各自的血壓水平，結(jié)果如圖4B所示，可見特異性敲除巨噬細胞AMPKα1會導致基礎(chǔ)水平的收縮壓顯著降低(對照鼠 vs敲除鼠[收縮壓(123.5±3.577)vs.(107.5±4.814)mmHg， P＝0.037]，而兩組小鼠的舒張壓和體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義[(對照 vs.敲除，舒張壓(74.17±1.53)vs.(70.88±3.61)mmHg，P＝0.17；體質(zhì)量(5±0.74)vs.(23.86±0.48)g，P＝0.15]。

圖4 檢測不同基因型小鼠的基礎(chǔ)血壓差異 A：Cre野生型小鼠在不注射和注射他莫昔芬條件下的基礎(chǔ)血壓；B：Cre野生型小鼠和Cre陽性小鼠都注射他莫昔芬后的基礎(chǔ)血壓(與Cre野生型對照鼠相比，?P＜0.01)

討 論

高血壓是世界各國共同面對的重大公共衛(wèi)生疾病之一。以 SBP超過 140 mmHg、DBP超過 90 mmHg為標準，則全球約有10億人患有高血壓[6]。其中西方國家高血壓的發(fā)病率高達總?cè)丝诘?/3，且其發(fā)病率隨年齡增加而升高，在70歲左右的人群中約70%有高血壓[2]。我國同樣面臨著高血壓疾病發(fā)病率高的問題，2018年初發(fā)表的項研究證實，18歲以上人群中，約23.2%的受訪者患有高血壓，另有41.3%的受訪者處于高血壓前期[1]。高血壓容易累及多種臟器，如心臟、腎臟等，導致其損傷和發(fā)生纖維化病變，進而引起心梗、血管鈣化、主動脈瘤等諸多疾病[2，7]。這種損傷主要是通過促進炎癥反應(yīng)而造成的，巨噬細胞等炎癥細胞在其中發(fā)揮了重要作用。巨噬細胞按其表型和功能，可分為促進炎癥和纖維化損傷的M1型，以及發(fā)揮抗炎作用的M2型，其功能表型可以受所處微環(huán)境變化的影響而發(fā)生轉(zhuǎn)變，呈現(xiàn)出很強的可塑性[8]。目前的研究認為，高鹽、血管緊張素AngII等可以促進巨噬細胞分化為M1型、并增加在心臟、腎臟和血管的浸潤，從而促進高血壓的發(fā)展和靶器官的損傷[9-11]。此外，還有研究表明，巨噬細胞參與調(diào)控鹽離子誘導的血液變化[3]。因此，深入研究巨噬細胞在血壓調(diào)控和高血壓狀態(tài)下的功能和作用機制，將為高血壓及相關(guān)疾病的治療提供新的思路。

一磷酸腺苷激活依賴性蛋白激酶AMPK是調(diào)節(jié)細胞能量代謝和功能的核心激酶，其催化亞單位(α subunit)在巨噬細胞中主要表達為α1型。既往報道中，AMPK信號通路能夠抑制巨噬細胞的致炎功能，使之更多的表現(xiàn)為抗炎表型[5]。具體機制方面，JAK/STAT信號通路是已知調(diào)節(jié)巨噬細胞表型分化的幾條信號通路之一[12]，其中 STAT1介導IFNγ的信號，促進巨噬細胞分化為 M1型[12]，STAT3則是被廣泛證實促使巨噬細胞表現(xiàn)為 M2型[13]，而既往報道證實AMPK對STAT1和STAT3均有調(diào)控作用[14-15]。因此，AMPK可能通過多種機制，使巨噬細胞在不同微環(huán)境條件下分化為不同的表型，進而對血壓調(diào)節(jié)以及高血壓狀態(tài)下的器官損傷產(chǎn)生不同的作用。

鑒于AMPK廣泛存在于各種組織器官細胞中，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的保護作用，如抑制心肌和血管內(nèi)皮細胞凋亡等等[16-17]。為了避免非特異性敲除AMPK帶來的副作用，并清晰揭示AMPK對于巨噬細胞功能的影響，本研究采用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)，通過集落刺激因子的啟動子驅(qū)動表達雌激素受體-Cre融合蛋白，保證了在巨噬細胞中特異性表達Cre酶，并在他莫昔芬藥物誘導下將Cre酶定位到細胞核，剪切AMPKα1基因第三外顯子兩端的loxP位點，從而破壞AMPKα1基因結(jié)構(gòu)、實現(xiàn)巨噬細胞特異性的誘導敲除AMPKα1基因?；蛐丸b定和RNA鑒定結(jié)果都證實了敲除鼠構(gòu)建成功。在此基礎(chǔ)上，我們證實了這種敲除能夠顯著降低基礎(chǔ)收縮壓，證實敲除巨噬細胞AMPKα1基因?qū)ρ獕河忻黠@調(diào)節(jié)作用。鑒于既往文獻報道，高鹽誘導高血壓條件下，巨噬細胞浸潤到血管外膜，釋放TNF-α，抑制交感神經(jīng)α2-腎上腺素能自受體的功能，釋放更多的去甲腎上腺素，從而升高血壓[18]；也有文獻報道證實，特定條件下，巨噬細胞會釋放VEGFC，從而降低血壓[3]。而AMPK既可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的表型[5]，又參與調(diào)控 VEGF-eNOS等信號通路[19]，因此，敲除AMPK可能影響了巨噬細胞上述兩方面的功能，從而降低血壓。后續(xù)的研究工作將從這些方面深入分析巨噬細胞調(diào)控血壓的機制。