胡蒙亮 任航江 韓亭亭 滿永 黎健 李國(guó)平

隨著生活方式的改變和肥胖的流行，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD)已發(fā)展成為一個(gè)世界性的健康問題，其病理表現(xiàn)為肝臟中TG的異常積累超過肝重的5%[1]。而另一方面，脂質(zhì)代謝異常也是心血管疾病的危險(xiǎn)因素，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。研究表明，I型11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1，11β-HSD1)在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[3]，但具體機(jī)制仍然知之甚少。

近年來，隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，RNA-seq已成為基因研究中不可或缺的強(qiáng)大平臺(tái)，對(duì)尋找生物標(biāo)志物和研究疾病機(jī)制有非常重要的意義[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是超過200個(gè)核苷酸組成的轉(zhuǎn)錄物，其缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳中有重要作用[5]。lncRNA參與多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞分化，腫瘤發(fā)生，免疫應(yīng)答等[6]。已有研究顯示，lncRNA是NAFLD發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[7]，lncRNA的遺傳變異與NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。然而 lncRNA是否參與了肝臟特異性 11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟的脂質(zhì)蓄積過程尚不清楚。

為了揭示lncRNA和mRNA在肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積中發(fā)揮的作用，本研究應(yīng)用RNA-seq技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析肝臟特異性 11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟 mRNA和lncRNA表達(dá)譜的特點(diǎn)，從新的視角探討NAFLD的發(fā)病機(jī)制，為NAFLD的治療提供新的思路與線索。

材料與方法

1.動(dòng)物飼養(yǎng)和肝臟樣本提取 從人的肝臟提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板擴(kuò)增出目的序列11β-HSD1，并以白蛋白為啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。將構(gòu)建好的表達(dá)載體酶切線性化后顯微注射入小鼠受精卵原核，并移植入同期發(fā)情的假孕母鼠輸卵管中，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠的F0代，通過回交和PCR鑒定篩選出穩(wěn)定表達(dá)11β-HSD1的品系為肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠，并以PCR鑒定11β-HSD1為陰性的同窩小鼠作為野生型。將小鼠保持在溫度和濕度特定(20～24℃，45%～55%濕度)的環(huán)境中，可自由獲取食物和水，并經(jīng)北京醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在3個(gè)月齡時(shí)分別收集來自不同組小鼠的肝臟組織。

2.材料 乙酰輔酶A羧化酶(ACC1)，硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD1)、脂肪酸合成酶(FAS)抗體購自Cell Signaling Technology。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1)抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司。11β-HSD1抗體購自美國(guó)R＆D公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG相關(guān)抗原抗體、HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG相關(guān)抗原抗體、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購自北京中杉金橋生物公司。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Thermo公司。動(dòng)物飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

3.TG檢測(cè) 喂養(yǎng)小鼠3個(gè)月齡時(shí)，禁食4 h并稱量小鼠體質(zhì)量，進(jìn)行麻醉處死后收集肝臟組織，稱重后凍于液氮備用。切取肝臟組織100 mg左右，根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行肝臟脂質(zhì)內(nèi)容物提取，酶法測(cè)定TG含量。

4.油紅O染色 取小塊肝臟組織，OCT包埋，切為8～10 μm厚的冰凍切片并貼片于潔凈載玻片。10%甲醛固定15 min，PBS洗1 min，60%異丙醇浸洗數(shù)秒，取出切片并完全干燥后油紅O工作液室溫染色30 min，60%異丙醇分化數(shù)秒，PBS洗3次，蘇木素復(fù)染核8 s，流水沖洗返藍(lán)，甘油封片后鏡檢，照相。

5.蛋白質(zhì)印跡 通過10%SDS-PAGE凝膠電泳分離肝臟組織蛋白提取物(20μg蛋白質(zhì))，PVDF膜(Millipore)濕轉(zhuǎn)3 h，用8%脫脂奶粉封閉1 h，然后與相應(yīng)一抗在4℃溫育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。相應(yīng)二抗室溫孵育3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用化學(xué)發(fā)光液顯影，并用凝膠成像儀照相。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

6.RNA樣品質(zhì)量檢測(cè)及文庫構(gòu)建 提取兩組樣品肝臟組織總RNA，在各組中分別將三個(gè)樣本混合成一個(gè)樣本，并重新編號(hào)。Nano Drop ND-1 000分光光度計(jì)對(duì)RNA濃度及質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估(2.2＞OD260/OD280＞1.8)；瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA純度。將純化的RNA斷裂為長(zhǎng)度接近200 bp的碎片，將處理后的RNA片段反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行文庫構(gòu)建。

7.RNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析 使用Illumina HiSeqTM2500工作平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。通過軟件Tophat2將測(cè)序獲得的核苷酸長(zhǎng)度(Reads)比對(duì)至小鼠全基因組。使用DEG seq軟件包計(jì)算基因差異表達(dá)情況。根據(jù)差異表達(dá)倍數(shù)、P值和表達(dá)量(FPKM)篩選差異表達(dá)的mRNA和lncRNA(差異倍數(shù)＞1.5，P＜0.05且 FPKM＞0.5)。 FPKM(Fragments Per Kilo bases per Million fragments)，即每百萬測(cè)序片段中來自某一基因/轉(zhuǎn)錄本每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目，表示表達(dá)豐度，F(xiàn)PKM

通過GO和KEGG PATHWAY分析對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行生物學(xué)過程的富集和脂質(zhì)代謝通路的分析，篩選出與脂代謝相關(guān)的差異顯著的mRNA和lncRNA。GO分析時(shí)通常采用二級(jí)或更低水平的分類：細(xì)胞學(xué)組件(cellular component，CC)，用于描述亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、位置和大分子復(fù)合物，如核仁、端粒和識(shí)別起始的復(fù)合物等；分子功能(molecular function，MF)，用于描述基因、基因產(chǎn)物個(gè)體的功能，如與碳水化合物結(jié)合或ATP水解酶活性等；生物學(xué)途徑(biological process，BP)，指分子功能的有序組合，達(dá)成更廣的生物功能，如有絲分裂或嘌呤代謝等。目標(biāo)基因集合的Pathway的分類和富集分析，提示不同基因如何相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，有助于進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes京都基因和基因組百科全書)是有關(guān)Pathway研究的主要公共數(shù)據(jù)庫。KEGG系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫，通過圖形來表示細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程，例如代謝，膜運(yùn)輸，信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。

8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 隨機(jī)選取部分與脂質(zhì)代謝相關(guān)的顯著上調(diào)/下調(diào)的mRNA和lncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)驗(yàn)證其表達(dá)水平。利用primer軟件根據(jù)NCBI中基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。收集15 mg肝組織用TRIZOL試劑(Invitrogen，USA)提取總RNA，測(cè)定濃度及RNA質(zhì)量后，取5μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，將cDNA稀釋20倍后進(jìn)行目的基因的檢測(cè)，總反應(yīng)體系為 20 μL：2ΧSYBR Green PCR Mix 10 μL，上下游引物各 1μL，模板cDNA 1 μL，加 ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。 反應(yīng)完畢后分析產(chǎn)物溶解曲線判斷反應(yīng)的特異性并通過計(jì)算2-△△ct得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量(實(shí)驗(yàn)樣品以β-actin為內(nèi)參，以野生型-1為基準(zhǔn))，并與 RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

表1 檢測(cè)基因的引物

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積 與野生型小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟11β-HSD1顯著增加[(1.000±0.051)vs.(3.486±0.135)，P＜0.001，圖 1 A]，但兩組小鼠體質(zhì)量并差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體質(zhì)量分別為[(31.33±2.89)vs.(32.72±3.47)，圖 1B]。實(shí)驗(yàn)組小鼠肝質(zhì)量為(1.91±0.11)g，顯著高于野生型小鼠的(1.52±0.12)g(P＜0.05，圖1C)，并且實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量的比值也顯著高于野生型小鼠[(0.046±0.005)vs.(0.059±0.006)，P＜0.05，圖1D]。油紅O染色顯示相較于野生型小鼠，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織脂滴大而富集(圖1F)。除此之外，酶法定量檢測(cè)TG含量結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟TG含量增加[(39.61±3.32)vs.(75.47±3.15)，P＜0.05，圖1E]，這一結(jié)果與油紅O染色結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)肝臟特異性 11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積。

圖1 肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠表型 A：小鼠肝臟組織11β-HSD1蛋白表達(dá)水平；B：小鼠體質(zhì)量統(tǒng)計(jì)圖；C：小鼠肝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)圖；D：小鼠肝質(zhì)量/體質(zhì)量比值統(tǒng)計(jì)圖；E：肝臟組織中TG含量測(cè)定結(jié)果；F：肝臟組織中脂質(zhì)油紅O染色結(jié)果 注：與對(duì)照組比較，n＝10，?P＜0.05， ???P＜0.001

圖2 肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白增加 A：Western blot檢測(cè)脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白水平；B：Western blot條帶灰度分析統(tǒng)計(jì)圖 注：n＝10，?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001

2.肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加 對(duì)兩組小鼠肝臟組織提取總蛋白后，首先檢測(cè)了長(zhǎng)鏈脂肪酸合成途徑中主要的調(diào)控蛋白，結(jié)果顯示(圖2)，相較于野生型小鼠，肝臟特異性 11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中SREBP1顯著增加(P＜0.05)，其下游調(diào)控蛋白FAS(P＜0.001)，SCD1(P＜0.01)也明顯上調(diào)，脂肪酸合成通路重要蛋白ACC1表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。這些結(jié)果說明肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠脂質(zhì)合成通路被激活了，11β-HSD1基因的過表達(dá)可能是導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)蓄積的原因之一。

3.lncRNA和mRNA的差異表達(dá)譜和基因途徑分析 收集野生型小鼠和肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟標(biāo)本進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，獲得mRNA和lncRNA的差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有323條lncRNA發(fā)生改變，其中123條上調(diào)，200條下調(diào)。與野生型小鼠肝臟樣本相比，實(shí)驗(yàn)組中約825條mRNA(376條上調(diào)和 449條下調(diào))表達(dá)不同。此外，有 13條lncRNA和5條mRNA在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)差異倍數(shù)超過野生型小鼠的5倍。為了闡明差異表達(dá)基因在肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積中的生物學(xué)過程和分子機(jī)制，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了GO富集和通路富集分析。結(jié)果顯示差異表達(dá)的RNA主要參與脂質(zhì)代謝、脂質(zhì)生物合成和脂肪酸代謝等生物學(xué)過程。在脂代謝相關(guān)通路中，共有 198條lncRNA差異表達(dá)，其中72條上調(diào)，126條下調(diào)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了77條差異表達(dá)的mRNA(35條上調(diào)，42條下調(diào))。表2中顯示了脂質(zhì)代謝途徑中10個(gè)最豐富的GO條目。表3中顯示了與脂代謝相關(guān)的差異最顯著的10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的mRNA。表4中顯示了與脂代謝相關(guān)的差異最顯著的10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的lncRNA。

表2 差異最顯著的10個(gè)脂質(zhì)代謝生物學(xué)過程富集的GO條目

表3 差異最顯著的10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的mRNA

表4 差異最顯著的10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的lncRNA

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果，在篩選出的與脂代謝途徑相關(guān)的顯著上調(diào)/下調(diào)的 mRNA和 lncRNA中隨機(jī)選擇 10條(上調(diào)Apoa5， Pltp， Tecr， NONMMUT015228.2， NONMMUT026827.2； 下 調(diào) Apoc3， Hsd3b7， Abca8a，NONMMUT006006.2， NONMMUT044708.2)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)(n＝10)。檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)一致，表明RNA-Seq測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可信。但實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果所示的差異表達(dá)倍數(shù)要比RNA-Seq測(cè)序的結(jié)果小，這可能是測(cè)序數(shù)據(jù)放大了RNA表達(dá)倍數(shù)差異。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證部分基因表達(dá)水平(以野生型-1為基準(zhǔn))

討 論

NAFLD是一種常見的肝臟疾病，影響30%的發(fā)達(dá)國(guó)家和越來越多的發(fā)展中國(guó)家人口，嚴(yán)重危害人類健康[9]。研究表明，11β-HSD1與肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[3]，在NAFLD的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，但其發(fā)病機(jī)制仍然知之甚少。

11β-HSD1作為糖皮質(zhì)激素的局部活化酶，其過表達(dá)是肝臟脂質(zhì)蓄積的重要因素。以前的研究結(jié)果顯示，脂肪組織特異性過表達(dá)11β-HSD1的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為完全代謝綜合征，包括血脂異常，胰島素抵抗性糖尿病和高血壓[10]。肝臟過表達(dá)11β-HSD1的小鼠發(fā)展為脂肪肝，胰島素抵抗和高血壓，但不表現(xiàn)為肥胖[11-12]。本研究采用肝臟組織特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，檢測(cè)到肝臟脂質(zhì)大量蓄積，形成脂肪肝，而體質(zhì)量并未發(fā)生改變。長(zhǎng)鏈脂肪酸合成通路被激活，脂肪酸合成途徑的主調(diào)控因子SREBP1表達(dá)顯著增加，同時(shí)激活了下游通路FAS、SCD1的表達(dá)，脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白ACC1含量也顯著增加。這為11β-HSD1過表達(dá)后引起肝臟脂質(zhì)蓄積提供了一個(gè)解釋。此外，缺乏11β-HSD1的小鼠能夠抵抗飲食誘導(dǎo)的肥胖，并且增加胰島素敏感性[13]。這些研究均表明11β-HSD1對(duì)于肝臟脂質(zhì)蓄積的作用。

lncRNA是由長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，可通過多種方式參與基因的調(diào)控和蛋白質(zhì)的合成，影響代謝過程，并與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14]。越來越多的證據(jù)表明lncRNA可能在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。Yuan等[5]使用基因芯片檢測(cè)了高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠肝臟組織中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)譜，表明lncRNA可能參與了小鼠NAFLD的過程。Guo等[15]研究發(fā)現(xiàn)，臨床用于治療NAFLD的藥物二甲雙胍可通過干擾lncRNA的表達(dá)而達(dá)到治療目的。這些研究提示探尋lncRNA在NAFLD中的作用機(jī)制利于實(shí)現(xiàn)對(duì)NAFLD的靶向治療。

本實(shí)驗(yàn)通過RNA-seq技術(shù)及生物信息學(xué)分析對(duì)肝臟組織特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟的lncRNA和mRNA表達(dá)譜的改變進(jìn)行了初步探索。根據(jù)基因功能聚類和途徑分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的mRNA和lncRNA涉及到脂代謝在內(nèi)的多個(gè)方面，提示其參與脂質(zhì)代謝調(diào)控，從而影響了肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積的過程。在脂代謝相關(guān)通路中，共有198條lncRNA差異表達(dá)，其中72條上調(diào)，126條下調(diào)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了77條差異表達(dá)的mRNA(35條上調(diào)，42條下調(diào))。隨機(jī)挑選10條基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，差異變化結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)基本一致。本研究的另一發(fā)現(xiàn)是，在富集的前十條脂代謝相關(guān)通路中反復(fù)出現(xiàn)了Apoa5。Apoa5在肝臟中顯著表達(dá)，其編碼的蛋白質(zhì)是載脂蛋白，是幾種脂蛋白如VLDL、HDL、乳糜微粒的組分，影響血漿TG水平[16]。在本研究的測(cè)序結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)肝臟組織特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠樣本中Apoa5表達(dá)相比野生型升高了2.3倍，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果也與其一致。之前已有研究報(bào)道，Apoa5參與NAFLD的發(fā)展[17]。在HepG2細(xì)胞中敲低apoA5導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著降低[18]。二甲雙胍通過抑制肝臟Apoa5表達(dá)降低ob/ob肥胖小鼠的血漿 TG[19]。此外，與Apoa5共表達(dá)的 lncRNA NONMMUT039532.2和lncRNA NONMMUT065550.2均表現(xiàn)為約7倍的上調(diào)，提示其可能通過Apoa5參與脂代謝的調(diào)控。

目前關(guān)于lncRNA與疾病關(guān)系的研究，大多利用基因芯片、RNA-Seq等技術(shù)對(duì)lncRNA的表達(dá)情況進(jìn)行全面的篩選，得到基因差異表達(dá)譜并進(jìn)一步功能驗(yàn)證。然而不同的基因篩選技術(shù)存在較大差異[20]。相較于微陣列芯片技術(shù)，RNA-Seq具有檢測(cè)范圍更廣、定量更準(zhǔn)確、可重復(fù)性更高、分析更可靠、需要的樣本量更少等優(yōu)勢(shì)。但是，RNA-seq也面臨著一些挑戰(zhàn)，包括大量的數(shù)據(jù)信息處理和分析等。

總之，本研究檢測(cè)了兩組肝臟樣本RNA的表達(dá)譜，初步篩選出顯著差異表達(dá)的mRNA和lncRNA，為下一步分子機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)將進(jìn)一步通過基因過表達(dá)和RNA干擾等技術(shù)方法對(duì)以上篩選出的差異表達(dá)的RNA進(jìn)行功能驗(yàn)證，以揭示其在肝臟特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積中的作用機(jī)制。