范麗 姚亞妮 李瑜

心肌纖維化會引起心臟心室壁增厚，誘發(fā)心肌重構(gòu)最終導(dǎo)致心力衰竭，主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)過度沉積和膠原比例失調(diào)且排列紊亂[1]。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)作為β-腎上腺素能受體的激動劑，通過介導(dǎo)兒茶酚胺的自氧化產(chǎn)生高細胞毒性的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，導(dǎo)致心臟功能紊亂[2]。

地爾硫卓通過結(jié)合細胞膜上的鈣通道蛋白來抑制鈣離子內(nèi)流，能夠有效緩解心絞痛、心力衰竭和動脈粥樣硬化等心血管疾病[3-4]。尚未有研究報道其對心肌纖維化的保護作用。本研究旨在評價地爾硫卓對大鼠心功能、血流動力學(xué)以及組織形態(tài)學(xué)和膠原沉積的影響，從抗氧化和抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路兩方面探討地爾硫卓對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化發(fā)揮保護作用的機制。

材料與方法

1.實驗材料 (1)試劑：地爾硫卓購買自天津田邊制藥有限公司(國藥準字H12020126，1506042)。異丙腎上腺素購買自Sigma公司。戊巴比妥鈉購買自北京化學(xué)試劑公司。HE染色試劑盒購買自武漢博士得生物工程有限公司。Masson試劑盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒購買自南京建成生物工程研究所。Collagen I和Collagen III抗體購買自北京博奧森公司，S-P免疫組化試劑盒購買自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。NF-κB、轉(zhuǎn)錄生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)以及GAPDH等單克隆抗體均購買自Cell signal公司，山羊抗兔HRP-IgG購買自Santa Cruz公司。BCA蛋白測定試劑盒購買自北京索萊寶生物科技有限公司，超敏ECL化學(xué)試劑盒購買自上海西唐生物科技有限公司。

(2)實驗動物：SPF級，雄性，Sprague-Dawley大鼠，30只，6周齡，體質(zhì)量220～260 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號：65000700000045。動物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，分籠飼養(yǎng)，可自由獲取水和食物，12 h交替照明，室溫保持在(22±1)℃，濕度45%～65%，整個動物實驗過程嚴格遵照“Guide for the care and use of laboratory animals from the national institutes of health”[5]。

2.方法 (1)動物分組及給藥：30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組、模型組和地爾硫卓組。除正常對照組，其他兩組均采用皮下注射異丙腎素的方法構(gòu)建心肌纖維化模型，2 mg·kg-1·d-1連續(xù)注射10d[6]。地爾硫卓組以灌胃的方法給予10 mg·kg-1·d-1地爾硫卓。正常對照組和模型組的大鼠灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥4周。

(2)心電圖和血流動力學(xué)檢測：體表心電圖的檢測判斷大鼠心功能。大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定于恒溫鼠板上，用四肢電極分別插入大鼠肢端皮下，在用心電圖電極固定在雙上肢(右上肢紅色、左上肢黃色)和雙下肢(左下肢綠色、右下肢黑色)，使用RM6240生理信號采集處理系統(tǒng)記錄標準II導(dǎo)聯(lián)心電圖。

左心室插管術(shù)檢測血流動力學(xué)指標[7]。暴露頸動脈，結(jié)扎心臟遠端，用動脈夾夾住近心端，血管下穿線備用，動脈壁上行一斜切口，將充滿肝素0.9%氯化鈉溶液的動脈插管由切口向心臟方向插入動脈。松開動脈夾，推進動脈插管并扎緊，5～10 min后記錄麻醉狀態(tài)下血流動力學(xué)指標。

(3)HE染色和Masson染色及S-P免疫組織化學(xué)法：HE染色：待大鼠麻醉后腹主動脈取血，快速取出心臟組織，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液沖洗后，分離出心臟左心室上部組織，4%多聚甲醛固定24 h。乙醇逐級脫水，二甲苯、石蠟處理，包埋并制成4 μm厚的切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，蘇木精-伊紅染色后，進行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后進行鏡下拍照并觀察心肌形態(tài)變化。

Masson染色：取心臟左心室上部組織制成石蠟切片，預(yù)熱經(jīng)常規(guī)石蠟脫水后行雙蒸水洗滌。首先滴加Masson復(fù)合染色液染色5 min后，0.2%乙酸溶液清洗30 s，滴加10%磷鎢酸分化8 min，0.2%乙酸溶液清洗3次。加苯胺藍染色5 min后再次用0.2%乙酸溶液清洗3次。最后經(jīng)乙醇逐級脫水后，使用二甲苯透明，中性樹膠封片。待片子干燥后，鏡下拍照并觀察大鼠心臟組織膠原沉積的變化，膠原纖維呈藍色，胞質(zhì)、心肌細胞呈紅色。計算心肌膠原容積分數(shù)CVF(%)＝心肌膠原面積/所測視野面積×100%。

S-P免疫組化法：左心室肌組織標本固定和石蠟包埋同HE和Masson染色，經(jīng)脫蠟、水化、煮沸法修復(fù)，按照 S-P免疫組化試劑盒說明書操作。Collagen I和Collagen III的一抗分別以1∶400和1∶600的比例稀釋。顯微鏡下拍照并隨機選取五個視野。用Image-Pro plus 6.0計算Collagen I和Collagen III陽性面積。

(4)心肌組織中SOD、GSH-Px、MDA水平的檢測：取各組心肌組織，加入pH7.2 PBS勻漿稀釋成1%的組織勻漿，離心后收集上清以檢測心肌組織中SOD、GSH-Px、MDA等氧化應(yīng)激標志物的含量。測定按照SOD、GSH-Px、MDA試劑盒說明書進行。

(5)心肌組織中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白表達水平的檢測：蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠心肌組織中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白的表達水平。取各組大鼠心肌組織各100 mg，剪碎后加入裂解液和 PMSF，冰上勻漿后裂解 30 min。4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA定量待測樣品總蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%BSA室溫封閉2 h，TBST 洗膜。 加入 NF-κB、TGF-β1、CTGF 的單克隆抗體，4℃搖床孵育過夜，TBST清洗。加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫下振蕩孵育1 h，TBST清洗。滴加ECL超敏顯色液顯色后采用凝膠成像儀曝光，運用Image J獲得灰度值。

3.統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，通過One-Way ANOVA單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.地爾硫卓對心電圖和血流動力學(xué)指數(shù)的影響正常對照組的心電圖模式正常如圖1 A所示。而模型組的心電圖S-T段和T波的振幅明顯升高，QRS波的峰值衰減如圖1B所示(P＜0.05)。地爾硫卓組心電圖如圖1C所示，QRS波的峰值和且S-T段和T波的振幅有所恢復(fù)，說明地爾硫卓能逆轉(zhuǎn)因異丙腎上腺素引起的心功能障礙(P＜0.05)。

血流動力學(xué)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組的HR和LEVDP顯著升高，而LVSP和±dp/dt max顯著降低(P＜0.05)。地爾硫卓組的 HR、LVEDP顯著低于模型組，而LVSP和±dp/dt max明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠的ECG檢測結(jié)果波形代表圖 A：正常對照組；B：模型組；C：地爾硫卓組

表1 三組大鼠的血流動力學(xué)檢測結(jié)果(±s)

表1 三組大鼠的血流動力學(xué)檢測結(jié)果(±s)

注：與正常對照組相比較，?P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.05

項目 正常對照組 模型組 地爾硫卓組LVSP/mmHg 141.39±1.88 109.84±6.47? 127.43±7.26#LVEDP/mmHg 6.01±0.34 11.45±0.18? 7.59±0.32#+dp/dt max/(mmHg/s) 13 832±56.73 10 057±81.64? 12 733±68.75#-dp/dt max/(mmHg/s)-5 792.12±39.74 -11 893±92.12? -7 138±59.37#HR/(Beats/min) 308.14±5.27 395.49±4.81? 324.63±4.95#

2.HE染色、Masson染色和免疫組化法 HE染色觀察地爾硫卓對心肌組織病理改變的影響。結(jié)果顯示，正常對照組心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚且排列規(guī)則。模型組心肌細胞間質(zhì)增加，細胞斷裂且排列紊亂，橫紋肌消失，炎性細胞增多，伴有出血壞死。地爾硫卓組心肌排列紊亂和出血壞死程度明顯改善，出現(xiàn)極少量炎性細胞浸潤。

圖2 地爾硫卓對心肌組織形態(tài)學(xué)和膠原纖維沉積的影響 A：各組大鼠心肌組織的HE染色，Masson染色以及Collagen I和Collagen III的免疫組織化學(xué)代表圖(×200)。B：各組大鼠心肌組織中的膠原容積分數(shù)，Collagen I和Collagen III陽性率的結(jié)果統(tǒng)計圖。注：與正常對照組相比較，?P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.05

Masson染色結(jié)果中，正常對照組心肌間質(zhì)可見少量正常纖維化。模型組可見大量藍色的膠原纖維(P＜0.05)，其膠原容積分數(shù)(CVF)較正常對照組顯著增加(P＜0.05)。地爾硫卓組有部分間質(zhì)可見纖維化，有少量膠原纖維沉積，其CVF顯著低于模型組(P＜0.05)。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，模型組Collagen I和Collagen III的陽性面積率顯著高于正常對照組(P＜0.05)。地爾硫卓組Collagen I和Collagen III的陽性面積率顯著低于模型組(P＜0.05)。

3.地爾硫卓抑制ISO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng) 為了探究地爾硫卓保護心肌纖維化的作用機制，檢測了SOD、GSH-Px和 MDA等指標，見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組SOD、GSH-Px含量顯著低于正常對照組(P＜0.05)，MDA 顯著高于正常對照組(P＜0.05)。與模型組相比較，地爾硫卓組的SOD、GSH-Px含量顯著增加(P＜0.05)，而 MDA含量顯著降低(P＜0.05)。

表2 地爾硫卓對SOD、GSH-Px、MDA等含量的影響(±s)

表2 地爾硫卓對SOD、GSH-Px、MDA等含量的影響(±s)

注：與正常對照組相比較，?P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.05

類別 正常對照組 模型組 地爾硫卓組SOD/(U/mg prot) 12.97±2.31 6.35±1.84? 10.62±2.19#GSH-Px/(mg·mL-1) 4.89±0.18 2.21±0.24? 3.81±0.19#MDA/(U/mg prot) 6.58±0.72 13.47±1.13? 8.25±0.84#

4.心肌組織中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白的表達水平檢測 進一步檢測各組大鼠心肌組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF 等涉及心肌纖維化分子機制的蛋白的表達水平，來探討地爾硫卓發(fā)揮保護作用的機制。 與正常組相比，模型組中 NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表達水平顯著增加(P＜0.05)。與模型組相比，地爾硫卓組中 NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表達水平顯著降低(P＜0.05)，見圖3。

圖3 地爾硫卓對大鼠心肌組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF蛋白表達水平的影響 A：蛋白免疫印跡結(jié)果圖。B：各組大鼠心肌組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表達水平的統(tǒng)計圖。注：與正常對照組相比較，?P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.05

討 論

心肌纖維化是一個復(fù)雜的病理過程，廣泛存在于各類心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，如心律失常、心力衰竭及心肌肥厚等[8]。大劑量的ISO通過自身氧化而誘導(dǎo)大量自由基的生成和聚集，從而引起膜通透性的變化，進一步引起膠原沉積和心肌纖維化，使心肌舒張和收縮功能受到抑制[9]。本實驗通過異丙腎上腺素建立心肌纖維化大鼠模型，探討地爾硫卓對心肌纖維化的保護作用及其作用機制。

心電圖和血流動力學(xué)檢測是評價藥物對心血管功能影響的一種常用方法[10]。心電圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地爾硫卓能抑制異丙腎上腺素引起的QRS波的峰值和S-T段以及T波的改變，這提示地爾硫卓能改善心肌纖維化大鼠的心功能。臨床上常用LVEDP表示心臟的容量負荷，間接反應(yīng)舒張功能，其升高會導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)線粒體數(shù)目增加，增加了心肌細胞耗氧量，使得膠原纖維合成增加[11]。LVSP和+dp/dt max反映心臟收縮功能[12]。其中LVSP代表等容收縮期左心室內(nèi)壓力的變化，而+dp/dt max反應(yīng)室壁肌張力上升的變化速率。-dp/dt max是評價心肌舒張功能的客觀指標，反映左心室的充盈程度和舒張功能及順應(yīng)性。血流動力學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組HR、LVEDP升高，而LVSP和±dp/dt max降低說明ISO誘導(dǎo)使得大鼠心肌收縮和舒張功能降低。而地爾硫卓組的HR和LVEDP顯著低于模型組，同時LVSP、±dp/dt max等上升。說明地爾硫卓能改善ISO引起的左心室收縮和舒張功能不全。

心肌纖維化即心肌纖維膠原網(wǎng)的重構(gòu)，可通過Masson染色和免疫組化判斷心肌纖維化和膠原沉積情況。有研究表明，Collagen I和III是心肌膠原基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其含量是反映心臟舒張功能的客觀指標[13]。An等[14]發(fā)現(xiàn)I、III型膠原蛋白的表達量的增加誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生，阿托品的干預(yù)可以通過降低I、III型膠原蛋白的含量改善心肌纖維化的嚴重程度。本研究通過HE和Masson染色發(fā)現(xiàn)，地爾硫卓能顯著改善ISO引起的心肌結(jié)構(gòu)紊亂和間質(zhì)纖維化沉積現(xiàn)象。免疫組化檢測結(jié)果顯示，Collagen I和Collagen III的表達能被地爾硫卓顯著下調(diào)。

SOD、GSH-Px等內(nèi)源性抗氧化酶是體內(nèi)維持氧化/抗氧化平衡和清除自由基的首要物質(zhì)[15]。氧化應(yīng)激主要由ROS介導(dǎo)，能夠造成機體SOD、GSH-Px等抗氧化物質(zhì)被大量消耗，進而引起生物膜中脂質(zhì)成分發(fā)生氧化并產(chǎn)生MDA[16]。本研究結(jié)果顯示，ISO誘導(dǎo)后，大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，心肌細胞合成的抗氧化酶減少，無法清除心肌細胞內(nèi)積聚的自由基，加劇心肌纖維化的進程。地爾硫卓可通過增加大鼠心肌中SOD、GSH-Px含量，減少MDA的合成，對心肌纖維化產(chǎn)生抑制作用。

為了進一步探討地爾硫卓改善心肌纖維化的分子機制，通過免疫印跡法檢測了心肌組織中與促纖維化相關(guān)的相關(guān)蛋白 NF-κB、TGF-β1和CTGF等蛋白的表達情況。NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)纖維化反應(yīng)的經(jīng)典通路，其下游蛋白TGF-β1是關(guān)鍵的致纖維化因子，促進心臟成纖維細胞增殖和活化成肌成纖維細胞，進而上調(diào)I型和III型膠原蛋白表達[17-18]。有研究指出，TGF-β1的表達可以促進主動脈狹窄患者的心肌纖維化進程[19]。CTGF因具有明顯的絲裂原性和趨化性，能誘導(dǎo)成纖維細胞增殖，是發(fā)生心肌纖維化的重要因子[20]。免疫印跡結(jié)果顯示，模型組NF-κB、TGF-β1 和 CTGF 的表達顯著高于正常對照組，提示心肌纖維化與NF-κB信號通路的激活有關(guān)。與模型組相比，地爾硫卓組的 NF-κB TGF-β1和CTGF等蛋白的表達顯著降低，提示地爾硫卓介導(dǎo)NF-κB信號通路抑制心肌纖維化。

有研究認為ISO引起的心肌纖維化損傷與Ca2+超載和ROS產(chǎn)生有關(guān)。ROS的過度生成通過激活NF-κB通路來誘發(fā)促炎反應(yīng)和細胞凋亡的發(fā)生[21]。TGF-β和CTGF是NF-κB的下游促纖維化的蛋白，其表達上調(diào)可引起細胞外基質(zhì)的過度沉積，引起心肌纖維化[21-22]。地爾硫卓一方面通過抗氧化應(yīng)激來抑制NF-κB信號通路，另外一方面通過直接作用于NF-κB，從而引起下游的 CTGF下調(diào)，CTGF的下調(diào)介導(dǎo)了Collagen I和Collagen III的下調(diào)，即抑制了心肌纖維化的發(fā)生。綜上所述，地爾硫卓能改善心肌纖維化大鼠的心功能和血流動力學(xué)，減少心肌結(jié)構(gòu)損傷和膠原沉積情況，其作用的發(fā)揮與抗氧化應(yīng)激和抑制NF-κB信號通路有關(guān)。