何敏超，閆志英，張金峰，劉云云，陳小燕，許敬亮?

（1.中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省新能源和可再生能源研究開(kāi)發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，廣州 510640；2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，中國(guó)科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境微生物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610041；3.淮陰工學(xué)院，江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過(guò)程集成工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安，223003）

0 引 言

木聚糖酶在食品、制漿造紙、飼料、生物能源等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。在食品行業(yè)中，木聚糖酶可有效改善面團(tuán)的持水性和穩(wěn)定性，延長(zhǎng)食品貨架壽命[1]；在制漿造紙領(lǐng)域，可提高紙漿白度并降低化學(xué)漂白劑的用量[2]；在飼料行業(yè)，可降低水溶性木聚糖導(dǎo)致的食糜黏性增高，破碎植物細(xì)胞壁，釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；在生物能源領(lǐng)域中，木聚糖酶可以增大木糖的得率，增加總還原糖的量[3]。木聚糖酶通過(guò)改善纖維素酶的酶解率而降低纖維素酶的應(yīng)用成本[4]。木聚糖酶通過(guò)降解木聚糖及木寡糖來(lái)降低此二者對(duì)于纖維素酶酶解的空間位阻作用[5-6]。因此，通過(guò)木聚糖酶的應(yīng)用可以促進(jìn)木質(zhì)纖維素乙醇以及高附加值化學(xué)品生物精煉的發(fā)展。

木聚糖酶的研究側(cè)重于產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選及選育[7]、基因工程菌的構(gòu)建[8]、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等方面[9]。木聚糖酶酶解預(yù)處理后木質(zhì)纖維素的研究報(bào)道相對(duì)較少。預(yù)處理后液體中常含乙酸、阿魏酸、糠醛、5-羥甲基糠醛和香草醛。酵母利用酶解后的可發(fā)酵糖產(chǎn)生乙醇。已有研究報(bào)道表明，這些水解產(chǎn)物和發(fā)酵產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)纖維素酶的酶解起到抑制作用[10]。然而，僅有極少數(shù)的研究報(bào)道了水解產(chǎn)物對(duì)木聚糖酶酶解的影響作用[11]。黑曲霉是木聚糖酶和纖維素酶重要的生產(chǎn)菌，尚未見(jiàn)水解產(chǎn)物對(duì)黑曲霉木聚糖酶酶活影響的研究報(bào)道。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選出的產(chǎn)木聚糖酶野生菌株進(jìn)行分子鑒定及固態(tài)發(fā)酵單因素優(yōu)化，并對(duì)該木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，以期為今后該菌株大規(guī)模酶解預(yù)處理后農(nóng)業(yè)廢棄物原料提供前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑及儀器

土壤樣品采自廣西壯族自治區(qū)河池市環(huán)江縣木論自然保護(hù)區(qū)。

木聚糖（含量≥90%）購(gòu)自Sigma公司；D-木糖（含量≥99%）購(gòu)自上海源聚生物有限公司；3,5-二硝基水楊酸（含量≥98%）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。其他試劑均為市售分析純。

LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；HCQ-X 30℃恒溫震蕩器（上海一恒科技有限公司）；JG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；BIOTECK-EON酶標(biāo)儀（基因有限公司）；HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基。土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。土豆去皮，切成片，稱取200 g并加水1 000 mL，煮沸30 min，8層紗布過(guò)濾，取濾液并補(bǔ)足1 000 mL，然后加入瓊脂和葡萄糖，熔化、分裝并滅菌。

初篩培養(yǎng)基。木聚糖10.0 g/L，KNO31.0 g/L，MgSO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.0。

復(fù)篩培養(yǎng)基。玉米芯3.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，CaCl20.3 g/L，MgSO40.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，CoCl220 mg/L，MnSO41.6 mg/L，ZnSO41.4 mg/L，pH 5.6。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。玉米芯與麩皮3.6 g，固液比1∶2.5，液體為pH 5.6的Mandels營(yíng)養(yǎng)液[12]。Mandels營(yíng)養(yǎng)液為不加玉米芯的復(fù)篩培養(yǎng)基。

1.3 篩選方法

1.3.1 平板初篩

將1.0 g土樣加入裝有50 mL無(wú)菌生理鹽水的150 mL搖瓶中，搖床震蕩60 min。取1 mL搖勻的液體加入15 × 150試管中，注入9 mL無(wú)菌生理鹽水，搖勻后梯度稀釋至10-6。分別吸取10-3、10-4、10-5、10-6四個(gè)稀釋度的菌懸液0.25 mL涂布于初篩培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)，48～96 h觀察水解圈大小，選擇水解圈與菌落圈直徑比值較大的菌落進(jìn)行純化及后續(xù)研究。

1.3.2 搖瓶復(fù)篩

將初篩得到的菌株接入種子培養(yǎng)液中，150 r/min、30℃培養(yǎng)72 h后以2.5% 接種量接種至復(fù)篩培養(yǎng)液中，于相同條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d、5 d、6 d，吸取1 mL發(fā)酵液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)測(cè)定木聚糖酶活力。

1.4 分子生物學(xué)鑒定方法

采用改良十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB）法提取菌株總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA），選擇擴(kuò)增真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer,ITS）序列的通用引物ITS1：5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG CG-3’和ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’對(duì)曲霉SM751總DNA進(jìn)行序列的擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，52℃退火50 s，72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行割膠回收，并測(cè)序。將該序列與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行局部序列排比檢索（basic local alignment search tool, BLAST）比較分析，獲得相關(guān)種屬的18S核糖體DNA（ribosome deoxyribonucleic acid, rDNA）序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 單因素優(yōu)化方法

在初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米芯與麩皮總質(zhì)量為3.6 g、固液比為1∶2.5、液體為pH 5.6的Mandels營(yíng)養(yǎng)液）的基礎(chǔ)上，考察不同玉米芯與麩皮比例（9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、全玉米芯、全麩皮）對(duì)Aspergillus nigerSM751產(chǎn)木聚糖酶酶活的影響?？疾觳煌矗ㄏ跛徜@、酵母粉、尿素、磷酸氫二銨、碳酸銨、硫酸銨、氯化銨和蛋白胨）對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的影響?？疾觳煌跏紁H值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5）對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的影響?？疾觳煌纤龋?∶1.5、1∶2.5和1∶3.5）對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的影響。考察不同接種量（2.5%、5.0%、7.5%和10.0%）對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.6 木聚糖酶酶活測(cè)定方法

于15 mL的具塞刻度試管中加入1 mL的1%木聚糖溶液（0.2 M，pH 4.8的醋酸緩沖液配置）、0.5 mL醋酸緩沖液和0.1 mL適當(dāng)稀釋酶液于50℃條件靜止反應(yīng)30 min后加入2 mL的3,5-二硝基水楊酸溶液搖勻煮沸10 min，定容到15 mL于540 nm下測(cè)定吸光度值。空白中的酶液用滅活的酶液代替[13]。酶活力單位定義：在上述測(cè)定條件下，每1 mL粗酶液1 min水解產(chǎn)生1 μmol底物所需的酶量為一個(gè)酶活單位（international unit, IU）。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)木聚糖酶微生物的篩選與鑒定

在以木聚糖為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)觀察水解圈（22 mm）與菌落圈（18 mm）比值的初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩，從廣西壯族自治區(qū)環(huán)江縣木論自然保護(hù)區(qū)土樣中分離到一株木聚糖酶活性較高的菌株（1001.33 IU/mL），將其編號(hào)為SM751。根據(jù)ITS序列的變化進(jìn)行菌株SM751的種屬鑒定。菌株SM751的ITS序列被擴(kuò)增和測(cè)序，并保存于NCBI基因庫(kù)（登記號(hào)為KJ194466）。利用BLAST方法對(duì)該序列進(jìn)行比對(duì)，并使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。在圖1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，該菌株與Aspergillusniger表現(xiàn)出98%的相似性。該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC），其編號(hào)為CGMCC No.8670。

圖1 菌株Aspergillus niger SM751系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree of ITS rRNA sequences of Aspergillus niger SM751

2.2 玉米芯與麩皮不同比例對(duì)產(chǎn)酶的影響

玉米芯與麩皮是重要的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)廢棄物。在圖2中，以玉米芯為碳源時(shí)，木聚糖酶酶活為1 172.82 IU/g。以麩皮為碳源時(shí)，木聚糖酶酶活為7 367.83 IU/g，是玉米芯為碳源時(shí)酶活的6.28倍。隨著玉米芯比例的下降（9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1），木聚糖酶酶活呈上升趨勢(shì)（2 077.16 IU/g、2 688.10 IU/g、3 201.28 IU/g、3 531.18 IU/g、7 331.17 IU/g）。1∶1時(shí)的木聚糖酶酶活是其他比例酶活的兩倍到三倍。隨著麩皮比例的上升（1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9），木聚糖酶酶活分別為7 331.17 IU/g、 8 125.38 IU/g、7 551.11 IU/g、7 868.79 IU/g和7 050.14 IU/g。這表明Aspergillus nigerSM751吸收和利用玉米芯和麩皮混合物的機(jī)制比較復(fù)雜，且優(yōu)先利用麩皮作為碳源[14]。在玉米芯與麩皮比例為1∶3時(shí)，其木聚糖酶酶活力為8 125.38 IU/g，遠(yuǎn)高于其他混合比例的木聚糖酶酶活，因此選擇玉米芯與麩皮比例為1∶3作為后續(xù)發(fā)酵碳源。

圖2 玉米芯與麩皮不同比例對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of ratio between corncob and wheat bran on the xylanase activity of strain SM751

2.3 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

分別用1.4 g的硝酸銨、酵母粉、尿素、磷酸氫二銨、碳酸銨、硫酸銨、氯化銨和蛋白胨代替2.0 g的硫酸銨。在圖3中，以尿素作為氮源，其木聚糖酶酶活力最高（8 113.16 IU/g）。酵母粉木聚糖酶酶活力最低（5 962.69 IU/g）。因此，選擇尿素為最佳氮源。

圖3 不同氮源對(duì)菌株SM751產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of various nitrogen sources on the xylanase activity of strain SM751

2.4 初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

初始pH能夠影響微生物的生理和最終的木聚糖酶酶活。在圖4中，96 h、120 h和144 h的木聚糖酶酶活分別是8 772.97 IU/g、8 601.91 IU/g和6 720.40 IU/g，相應(yīng)的最佳初始pH值是3.5、3.5和5.0。最佳的初始pH值隨著時(shí)間的變化而變化。在96 h、120 h和144 h，木聚糖酶酶活最低的初始pH都是4.5。這可能是由于初始pH 4.5相較于其他初始pH不適合于Aspergillus nigerSM751發(fā)酵產(chǎn)酶。在120 h，pH 6.0的木聚糖酶酶活僅次于pH 3.5的酶活，這說(shuō)明菌株Aspergillus niger在偏酸性條件下也可以較好地產(chǎn)酶。選擇pH 3.5作為最佳的初始pH。

圖4 不同初始pH對(duì)菌株SM751產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of various initial pH on the xylanase activity of strain SM751

2.5 不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵工藝中，接種量是一個(gè)重要的影響因素。圖5中，96 h、120 h 和144 h最高的木聚糖酶酶活分別是8 504.16 IU/g、9 567.18 IU/g和7 123.46 IU/g，其相應(yīng)的最佳接種量分別是10%、10%和 7.5%。在96 h和120 h，2.5%接種量的木聚糖酶酶活高于5.0%和7.5%接種量的酶活?？傮w而言，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，相同接種量的木聚糖酶酶活呈下降趨勢(shì)。在接種量為10%時(shí)，120 h的木聚糖酶酶活大于144 h的木聚糖酶酶活。這說(shuō)明，較大的接種量不僅能促進(jìn)木聚糖酶的酶活，而且能夠縮短發(fā)酵時(shí)間。選擇10%作為最佳的接種量。

圖5 不同接種量對(duì)菌株SM751產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of inoculum on the xylanase activity of strain SM751

2.6 不同料水比對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，料水比是一個(gè)關(guān)鍵的影響參數(shù)。圖6顯示，96 h、120 h 和144 h的最大木聚糖酶酶活分別是9 090.66 IU/g、8 663.00 IU/g和8 235.35 IU/g，相應(yīng)的料水比是1∶3.5。在相同的發(fā)酵時(shí)間下，木聚糖酶酶活隨著料水比的增大而增大，并且料水比在1∶2.5、1∶3.5的條件下，木聚糖酶酶活是料水比1∶1.5的2倍。這說(shuō)明利用Aspergillus nigerSM751固態(tài)發(fā)酵時(shí)，水分對(duì)于產(chǎn)酶有極大的影響作用?？傮w而言，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，木聚糖酶的酶活呈下降趨勢(shì)。選擇料水比1∶3.5作為最佳的料水比。

圖6 不同料水比對(duì)菌株SM751產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of various ratio between solid and liquid on the xylanase activity of strain SM751

在玉米芯與麩皮比例為1∶3，1.4 g尿素為氮源，初始pH值為3.5，料水比為1∶3.5，接種量為10.0 %的條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，120 h后木聚糖酶酶活力為10 446.92 IU/g。

2.7 木聚糖酶的酶學(xué)特性

最適pH和最適溫度是重要的酶學(xué)特性，決定了酶的應(yīng)用條件。在50℃條件下，于pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5條件下分別測(cè)定木聚糖酶酶活力。以最大的酶活為100%，其他pH條件下酶活與最大酶活的百分?jǐn)?shù)為Y軸，做酶活殘留率曲線。在圖7中，該木聚糖酶有兩個(gè)最佳pH范圍，一個(gè)為3.0～4.5，另一個(gè)為5.0～6.0。在pH范圍為3.0～4.5，酶活殘留率為95%～97%。這個(gè)范圍內(nèi)較高的酶活殘留率有助于預(yù)處理后木質(zhì)纖維素中木聚糖的酶解[15]。在pH范圍為5.0～6.0內(nèi)，酶活殘留率高達(dá)98%～100%。這表明該酶在酸性和偏酸性條件下具有良好的酶解潛力。

圖7 不同pH對(duì)菌株SM751木聚糖酶酶活的影響Fig.7 Effect of pH on the xylanase activity of strain SM751

在最適pH 5.0下，分別于37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃條件下測(cè)定木聚糖酶酶活。以最高酶活力為100%計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖可知，最適溫度為45℃，50℃時(shí)酶活殘留率為97%。可見(jiàn)，45～50℃適合木質(zhì)素酶解產(chǎn)木聚糖。當(dāng)溫度高于50℃，木聚糖酶的酶活殘留率急劇下降。相較于最佳溫度，55℃和60℃的酶活殘留率分別為42.78%和3.87%。

圖8 不同溫度對(duì)菌株SM751木聚糖酶酶活的影響Fig.8 Effect of temperature on the xylanase activity of strain SM751

2.8 木聚糖酶對(duì)抑制物的耐受性能

木質(zhì)纖維素經(jīng)過(guò)酸處理、堿處理或者高溫液態(tài)水處理后，會(huì)產(chǎn)生一些有毒害作用的抑制物[10,16]。這些有毒的抑制物包括呋喃類化合物（糠醛、5-羥甲基糠醛）、乙酸、酚類化合物（香草醛、阿魏酸）。在釀酒酵母發(fā)酵酶解的葡萄糖會(huì)產(chǎn)生乙醇。因此，有必要對(duì)上述化合物影響木聚糖酶活性進(jìn)行研究。

在圖9中，中濃度和高濃度的糠醛可以激活木聚糖酶，其激活率分別可達(dá)7.63%和15.88%；而低濃度的糠醛微弱地抑制木聚糖酶，其抑制率為0.82%。中濃度和低濃度的5-羥甲基糠醛抑制木聚糖酶，其抑制率分別為7.01%和27.83%；而高濃度的5-羥甲基糠醛顯著激活木聚糖酶，其激活率可達(dá)18.35%?？紤]到糠醛可以與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)，因此設(shè)置了相應(yīng)的對(duì)照以消除這種反應(yīng)的影響[17]。此外，也有類似的研究表明，糠醛及5-羥甲基糠醛可以激活木聚糖酶的酶活[18]。Aspergillus nigerSM751所產(chǎn)的木聚糖酶對(duì)于糠醛和5-羥甲基糠醛具有良好的耐受性能。乙酸在低濃度、中濃度和高濃度對(duì)木聚糖酶具有輕微的激活作用，其激活率分別為0.2%、0.21%和3.92%。

酚類化合物（香草醛、阿魏酸）隨著濃度的變化，對(duì)于木聚糖酶酶活的影響也不同[11,19]。香草醛在低濃度時(shí)，其對(duì)木聚糖酶的抑制率為4.54%，而在中濃度和高濃度時(shí)，其對(duì)木聚糖酶的激活率分別是1.65%和7.84%。阿魏酸在低濃度時(shí)對(duì)于木聚糖酶沒(méi)有影響，而在中濃度和高濃度時(shí)，其對(duì)木聚糖酶的激活率分別為3.09%和5.16%。LI等[20]的研究結(jié)果則表明香草醛和阿魏酸抑制木聚糖酶的酶活。然而，另有研究結(jié)果顯示，阿魏酸可以激活木聚糖酶酶活[21]。

圖9 不同抑制物對(duì)菌株SM751木聚糖酶酶活的影響Fig.9 Effect of inhibitory compound on the xylanase activity of strain SM751

乙醇在中濃度時(shí)對(duì)木聚糖酶酶活沒(méi)有影響，然而在低濃度和高濃度下可以輕微地激活木聚糖酶酶活，其激活率分別為1.44%和3.92%。VAN DYK等[22]的研究結(jié)果顯示乙醇抑制木聚糖酶的酶活。

利用Aspergillus nigerSM751所產(chǎn)的木聚糖酶酶解高溫液態(tài)水預(yù)處理之后的甘蔗渣。高溫液態(tài)水的預(yù)處理?xiàng)l件為：料水比1∶20、180℃和4 Mpa下處理20 min。預(yù)處理之后，在50℃、150 r/min和pH 4.0下添加500 IU/g的木聚糖酶酶解24 h，木糖得率為75.63%。

3 結(jié) 論

研究了新篩選菌株Aspergillus nigerSM751固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的潛力。該菌株能夠產(chǎn)生高水平的木聚糖酶，并且所產(chǎn)的粗酶具有良好的pH穩(wěn)定性。木聚糖酶酶活最高可達(dá)10 446.92 IU/g。此外，該酶對(duì)糠醛、5-羥甲基糠醛、香草醛、阿魏酸和乙醇具有優(yōu)良的耐受性。23.0 g/L的糠醛和25.7 g/L的5-羥甲基糠醛對(duì)木聚糖酶的激活率分別達(dá)15.9%和18.4%。該酶的最適溫度、最適pH和對(duì)抑制物的優(yōu)良耐受性使得該酶在酶解預(yù)處理后木質(zhì)纖維素方面具有良好的應(yīng)用潛力。