張海濤

518000深圳市第二人民醫(yī)院胃腸外科，廣東 深圳

在臨床中腎癌是一種較為常見多發(fā)性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，隨人們生活質(zhì)量的不斷變化，目前腎癌的并發(fā)率呈現(xiàn)大幅度的上升趨勢，且成年人中并發(fā)率較高，主要致病原因為腎實質(zhì)泌尿小管的上皮病變，但發(fā)病機制較為復(fù)雜。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，患者大多表現(xiàn)出代謝功能下降和自身免疫功能異常，生理功能均有所減退趨勢。在臨床中大腸癌為一種常見多發(fā)消化道惡性化腫瘤。病發(fā)部位結(jié)腸且較隱匿，在早期時無明顯癥狀，一般病理確診均在中晚期，錯過最佳治療時期，預(yù)后性較差。尤其在中晚期階段極易發(fā)生相關(guān)并發(fā)癥，易致腸道內(nèi)廢棄物不能順利排出腸道發(fā)生堵塞[1-2]。相關(guān)研究表明，Vinculin經(jīng)VCL基因尾部與頭部相互作用，有助于調(diào)節(jié)細胞連接、黏附、擴散等功能。作為細胞遷移的抑制劑，因Vinculin可加強細胞黏附性，癌癥侵襲性與轉(zhuǎn)移性能與細胞-細胞、細胞-細胞外基質(zhì)黏附性具有密切相關(guān)性。癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，最關(guān)鍵的是通過腫瘤細胞獲得侵入基底膜的能力，同時侵襲周圍組織，與癌癥轉(zhuǎn)移、擴散及死亡密切相關(guān)。腫瘤細胞經(jīng)過重組肌動蛋白細胞骨架從而改變細胞主要形狀。Vinculin 為黏著斑蛋白的重要組成部分，主要通過對肌動蛋白重組與細胞黏附起到調(diào)控作用，當用siRNA 干擾法對其Vinculin基因表達阻斷，有利于觀察細胞遷移情況[3]。本研究課題主要探討Vinculin在大腸癌及腎癌組織中的表達及臨床診斷意義。在大腸癌及腎癌組織中，對Vinculin表達情況進行分析，初步探討作為腫瘤標記物的診斷意義。因此通過測定Vinculin在大腸癌及腎癌組織患者中的表達情況，為未來臨床治療提供指導(dǎo)意義。

資料與方法

收治大腸癌及腎癌女性患者56 例，所有入組患者均符合診斷標準，均需病理科對其病理類型進行證實，年齡19～65歲，平均(53.1±7.3)歲。其中大腸癌患者的癌組織和對應(yīng)癌旁黏膜上皮組織共30例，腎癌及癌旁組織部位26例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，同時患者均在知情同意書上簽字。本次研究所有患者均需要符合以下幾點條件：患者活檢病理檢查確診為癌；所有患者未經(jīng)過任何手術(shù)及放化療治療。排除標準：合并心、肝、腎等其他疾病者；有精神異常疾病患者；非自愿參加本次研究患者。

方法[4-5]：①組織內(nèi)總蛋白濃度的測定：所取組織樣本需要經(jīng)過充分研磨為粉末狀。加入裂解緩沖液(30 mmol/L Tris-HCL，9 mmol/L 尿素，65 mmol/L 二硫代蘇糖醇，2 mmol/L PMSF 酶物)，在室溫下振蕩1 h 后充分溶解混合物，用RNA 酶與DNA 酶除去RNA 和DNA，再離心50 min，4℃下留取上清液為總蛋白質(zhì)。再染色用考馬斯亮藍試劑，595 nm處以不同濃度標準蛋白，測定吸光度及繪制標曲，從而計算出在組織中的蛋白濃度。②分離蛋白、制備水解多肽混合物：需要對各組織內(nèi)總蛋白進行電泳分離，降低組織內(nèi)蛋白尿素濃度，用25 mmol/L NH4HCO3清洗后加入一定體積1 mmol/L 二硫代蘇糖醇，在56℃下避光放置1 h，等待降至室溫，然后再加入1 mmol/L 的2-碘乙酰胺，室溫、避光30 min。按1∶50 比例，加測序級TPCK，修飾胰蛋白酶及待測蛋白37℃酶切過夜，真空后即得樣品，在-80℃冰箱儲藏。待用時BufferA 溶解樣品，取50 μg進行色譜上樣反向洗脫色譜。后洗脫出多肽，采用液質(zhì)聯(lián)用進行分析。③免疫印跡試驗：測定蛋白Vinculin采用免疫印跡試驗方法，驗證蛋白表達情況。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 14.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

總蛋白分析結(jié)果：從結(jié)果可知在大腸癌組織細胞中Vinculin呈現(xiàn)低表達，上調(diào)表達狀態(tài)在腎癌組織中，見圖1。

采用免疫印跡試驗方法驗證Vinculin的表達：在篩選出的56 例大腸及腎細胞癌及癌旁正常組織Vinculin表達中用免疫印跡試驗進行，結(jié)果顯示在大腸癌組織中表達水平呈明顯低于配對部位的癌旁組織；但腎癌組織Vinculin表達水平高于較配對部位的癌旁組織，見圖2。

討 論

隨社會不斷發(fā)展和生活水平提高，工作壓力及勞動強度加大，大腸癌病發(fā)率呈大幅度的上升趨勢。大腸癌主要分為結(jié)腸癌及直腸癌，具有強侵襲性、高復(fù)發(fā)性且轉(zhuǎn)移率死亡率高及難預(yù)后的特點。發(fā)起病機制較為復(fù)雜，若不及時對患者進行治療，將極大威脅人們的身體健康。多發(fā)人群為老年階段，尤其男性較女性發(fā)病率高，主因受遺傳、環(huán)境等多因素影響致腸黏膜上皮發(fā)生惡變現(xiàn)象。目前臨床主要表現(xiàn)為腹部隱痛、腹脹、嘔吐、便秘、大便無規(guī)律特征，可能還存在反跳痛或壓痛。腎癌又稱腎細胞癌，臨床上常作為腫瘤性病變，且發(fā)病率呈逐年增加，在中老年中居多[6]。有時因初期癥狀不太明顯，無引起重視，不能及時有效治療，隨病情進展可發(fā)生病變等，甚至導(dǎo)致多臟器功能不全或功能衰竭，最終死亡。目前可用的篩選治療手段有限，生存率仍舊很低，最重要的原因為遠處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)。大腸癌及腎癌在臨床上是一種較為普遍疾病，Vinculin蛋白為一類細胞骨架型蛋白，在整合素介導(dǎo)細胞-細胞外基質(zhì)及鈣黏附蛋白介導(dǎo)細胞-細胞連接部位的胞質(zhì)表面黏著處。因此對基因在癌細胞中的表達情況進行評估有重要意義。

在本研究中結(jié)果顯示，大腸癌及腎癌組織與正常癌旁組織的Vinculin 基因表達水平比較發(fā)現(xiàn)，大腸癌中表達水平明顯低于癌變組織患者；但腎癌組織Vinculin 表達水平較配對部位的癌旁組織高，為臨床治療提供一定的借鑒價值。

圖1 總蛋白分析結(jié)果

圖2 Vinculin的表達驗證