鄭文英 楊文娟 鄧敏(通訊作者)

510095廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所廣州惡性腫瘤治療轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室

胃癌的發(fā)病率居全球惡性癌癥的第4位，死亡率在癌癥中排第2 位。我國是胃癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，并且發(fā)病率呈逐年增加趨勢[1]，對人類健康造成嚴重威脅。胃癌目前的治療方式主要是以手術(shù)為主，輔以化療或放療。手術(shù)是現(xiàn)在唯一可以根治胃癌的治療手段，但是大部分胃癌被確診已為中后期，且多發(fā)生轉(zhuǎn)移，腫瘤發(fā)生全身轉(zhuǎn)移常導致患者無法進行根治性手術(shù)，因此轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的主要原因之一。所以，針對胃癌早期診斷和轉(zhuǎn)移機制的研究是臨床非常重要的課題。CLDN4 屬于緊密連接蛋白家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，CLDN4 在包括食管癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中存在高表達現(xiàn)象，并且其過表達與腫瘤預后不良相關(guān)[2]。本研究旨在研究CLDN4在胃癌的作用。

資料與方法

材料與試劑：人胃癌細胞系SGC7901、RPMI1640 培養(yǎng)基、小牛血清、Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體、TRIzol RNA 抽提試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR儀等。

圖1 MTS 檢測轉(zhuǎn)染CLDN4 siRNA 及對照細胞的增殖情況

圖2 transwell 細胞侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染CLDN4 siRNA及對照細胞的侵襲能力

方法：①細胞培養(yǎng)：使用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②細胞轉(zhuǎn)染：將細胞轉(zhuǎn)染前1 d 接種于6 孔板中，待貼壁細胞融合度達70%～80%時，用無血清培養(yǎng)基根據(jù)Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6 h換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)擴大培養(yǎng)以用于后續(xù)實驗。③qRT-PCR 檢測：用TRIzol 提取細胞的總RNA，采用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應體系如下：2X SYBR Green Master mix 10 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，Cdna 2 μL，無酶水7 μL。采用ABI 7500 fast 實時定量PCR 儀進行PCR 反應，反應條件：Cycle 1：(1×)，95℃30 s；Cycle 2：(40×)，95℃5s，60℃30s。④MTS法檢測細胞增殖活性：將細胞接種于96 孔板中，每組設(shè)6個復孔。細胞接種后24 h、48 h、72 h后分別加20 μL MTS檢測試劑，37℃培養(yǎng)3 h，用酶標儀測定570 nm 波長吸光度值。⑤transwell細胞侵襲實驗用胰酶消化細胞，用無血清培基重懸細胞，細胞計數(shù)。在transwell 下室加入含15% FCS 的培基700 μL。在transwell 上室加入細胞懸液250 μL，培養(yǎng)48 h，溫度控制在37℃。取出transwell，擦掉靠上室側(cè)膜的細胞，用10%福爾馬林中固定10 min，結(jié)晶紫染色，顯微鏡細胞計數(shù)。

統(tǒng)計學方法：采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料(±s)表示，采用t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

在SGC7901 細胞中轉(zhuǎn)染CLDN4 siRNA 后，通過qRT-PCR 檢測細胞CLDN4 表達水平，發(fā)現(xiàn)可轉(zhuǎn)染CLDN4 siRNA 顯著降低細胞CLDN4 表達水平，說明干擾效率高。檢測轉(zhuǎn)染CLDN4 siRNA 及對照細胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CLDN4 siRNA 細胞較對照細胞增殖速度明顯減慢，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨后通過transwell 細胞侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CLDN4 siRNA 細胞的侵襲能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。這些結(jié)果說明CLDN4 能促進胃癌細胞增殖、侵襲能力，見圖1和圖2。

討 論

胃癌是人類十大惡性腫瘤之一，是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其死亡率在所有癌癥中排第2 位，每年約有70 萬人死于胃癌，嚴重威脅著人類健康。胃癌的發(fā)生發(fā)展機制尚不十分清楚，一般認為胃癌是一個涉及多步驟、多階段、多基因改變的復雜過程，包括抑癌基因的失活、原癌基因的激活以及錯配修復基因的突變等。胃癌的易感因素多種多樣，主要是環(huán)境、遺傳和行為三者之間的相互作用。關(guān)鍵的環(huán)境因素是慢性感染幽門螺旋桿菌，特別是CagA菌株。目前對胃癌具體發(fā)病及轉(zhuǎn)移機制仍有很多尚待明確的地方。

已有研究顯示，CLDN4 在胰腺癌中呈現(xiàn)高表達，并且與腫瘤分級有關(guān)[3]。然而在胰腺癌細胞過表達CLDN4 抑制癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。在胃癌，CLDN4 被發(fā)現(xiàn)高表達于幽門螺旋桿菌相關(guān)的胃癌，長期暴露于幽門螺旋桿菌可導致CLDN4 的上調(diào)。關(guān)于CLDN4 在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用鮮見報道。本研究在胃癌細胞中干擾CLDN4 表達，并檢測胃癌細胞的增殖和侵襲能力。結(jié)果顯示，干擾CLDN4 表達后胃癌細胞增殖和侵襲能力下降，表明CLDN4 能促進胃癌細胞增殖、侵襲能力。

綜上所述，CLDN4 有望成為分子靶向治療的有效靶點之一。