謝 輝，陳 亞，雷愛玲，朱春燕，李楊梅，白玉婷，孫 鵬*，李貴節(jié),2*

1重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；2西南大學(xué)柑桔研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712

柑橘屬于蕓香科柑橘亞科植物[1]，很多品種具有藥用價值，常見中藥材包括陳皮、青皮、化橘紅、橘絡(luò)及橘核等。陳皮(CitriReticulataePericarpium)為曬干的成熟橘皮，入藥以陳為佳具有理氣和中、燥濕化痰、安胃和中、降逆止嘔等功效[2]。青皮(CitriReticulataePericarpiumViride)，即橘子未成熟的綠色干燥外皮，亦有用幼小果實曬干而成，具有破氣散結(jié)、疏肝止痛的作用[3,4]?；偌t(ExocarpiumCitriGrandis)為廣東地方柚的變種，具有利氣消痰、寬中散結(jié)的功效[5,6]。橘絡(luò)(CitriReticulataeRetinervus)即橘瓣上的白色絲絡(luò)，具有通血脈、理氣止痛及化痰的功效。橘核(CitriReticulataeSemen)為橘子的種子，具有理氣、止痛的功效[7]。

柑橘果實中含有大量的類黃酮物質(zhì)，常見成分包括屬于黃烷酮類物質(zhì)的蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷、橙皮素、柚皮素和屬于多甲氧基黃酮類的川陳皮素[8]。已有研究表明，蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷等黃烷酮糖苷具有抗脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒、延緩衰老、預(yù)防動脈粥樣硬化等多種作用[9-11]；而川陳皮素也有較強的抗腫瘤、抗真菌、抗動脈粥樣硬化和降低血清膽固醇等藥理活性[12,13]。提取柑橘類黃酮的常用方法有堿提取酸沉淀法、溶劑提取法、超聲波輔助提取、加熱回流提取等方法；分離純化的常用手段包括柱層析法、大孔樹脂吸附法、高速逆流色譜技術(shù)等方法[14]。固相萃取(SPE)是近年來廣泛應(yīng)用于食品、生物、藥學(xué)、環(huán)境等眾多領(lǐng)域的樣品前處理技術(shù)。SPE常用于處理組成復(fù)雜的液體樣品，能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品中不揮發(fā)和半揮發(fā)性目標物的萃取、凈化和濃縮的要求，具有去除干擾物質(zhì)、溶劑用量少、操作簡單快速等優(yōu)良性能[15-20]。本研究選取了陳皮、青皮、化橘紅、橘絡(luò)、橘核等常用的柑橘藥材作為檢測對象，采用乙醇浸提柑橘藥材中的川陳皮素和黃烷酮等目標物質(zhì)，運用SPE進一步去除雜質(zhì)和富集濃縮，采用高效液相色譜串聯(lián)二極管陣列檢測器(high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD)進行分離和分析檢測，進而了解目標類黃酮成分在柑橘不同藥用資源中的分布情況，以期為進一步研究其功能性和藥理作用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮、青皮、化橘紅、橘絡(luò)和橘核購自重慶萬家燕大藥房，由重慶第二師范學(xué)院重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心趙欣教授鑒定。甲醇、乙酸(色譜純)上海阿拉丁有限公司；無水乙醇(分析純)重慶川東化工(集團)有限公司。蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷、橙皮素、柚皮素及川陳皮素標準對照品(純度98%) 上海源葉生物科技有限公司，其物質(zhì)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 6個柑橘類黃酮標準物質(zhì)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of six citrus flavonoids注：1-蕓香柚皮苷；2-橙皮苷；3-柚皮苷；4-橙皮素；5-柚皮素；6-川陳皮素。Note:1-Narirutin;2-Hesperidin;3-Naringin;4-Hesperetin;5-Naringenin;6-Nobiletin.

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000 高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器(DAD)，德國Thermo Scientific公司；HyperSep C18SPE小柱 ，德國Thermo Scientific公司；0.22 μm有機相微孔濾頭，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 標準工作溶液的配制

分別稱取適量蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、川陳皮素標準品，用甲醇定容為1.0 mg/mL的儲備液；再用甲醇稀釋，配制濃度分別為10.0、15.0、20.0、30.0、100.0、200.0 μg/mL的標準工作溶液及相同濃度的混合標準液。

1.3.2 樣品處理

樣品粉碎后過60目篩，取約1.0 g細粉，精密稱量，加入20 mL 70%(體積分數(shù))乙醇，浸提1 h后過濾。將過濾后的液體稀釋至5%，稀釋液以1 mL/min流速通過甲醇活化后的固相萃取柱，再通過超純水清洗除雜。柱上吸附的目標物質(zhì)用5 mL甲醇洗脫，洗脫液過0.22 μm微孔濾膜后備用。

1.3.3 色譜及檢測條件

色譜柱：Thermo Scientific Accucore C18(4.6 mm×150 mm，2.6 μm)；流動相：A甲醇，B 0.5%乙酸水溶液，流動相梯度見2.2分離條件的選擇；定量檢測波長：283、285、290、335 nm；柱溫30 ℃；流速0.50 mL /min；進樣量5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提液稀釋對C18固相萃取效果的影響

利用C18SPE前處理的原理為分配層析。柑橘類黃酮都含有極性較弱的母環(huán)結(jié)構(gòu)，根據(jù)相似相溶的原理，它們依據(jù)取代基的不同易分布在中弱極性的物質(zhì)中。當(dāng)乙醇體積分數(shù)為70%的樣品提取液通過SPE柱時，由于流動相與C18固定相極性接近，大部分黃烷酮類物質(zhì)和川陳皮素會繼續(xù)保留在乙醇溶液中，僅少量保留在SPE柱上。降低乙醇體積分數(shù)，得到的稀釋液極性升高，則柑橘類黃酮物質(zhì)更傾向于保留在極性更弱的固定相表面，從而能夠?qū)崿F(xiàn)固相萃取和濃縮。根據(jù)上述原理，將陳皮浸提液稀釋至乙醇體積分數(shù)為20%、10%、5%，分別通過SPE柱，最終測得保留的類黃酮含量見表1。結(jié)果表明，5%體積分數(shù)乙醇稀釋液中黃烷酮和川陳皮素被SPE收集保留量最高，效果最好。繼續(xù)稀釋時，類黃酮的溶解性顯著降低，稀釋液呈現(xiàn)明顯渾濁狀態(tài)，導(dǎo)致SPE對類黃酮成分的保留嚴重降低，且結(jié)果重復(fù)性差(結(jié)果未顯示)。

表1 C18 SPE對不同乙醇濃度陳皮稀釋液中類黃酮物質(zhì)的收集保留量

2.2 色譜分離條件的選擇

6種物質(zhì)都含有苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)，性質(zhì)較為相似，因此采用梯度洗脫的方式進行分離?？紤]到黃烷酮類物質(zhì)即蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、柚皮素和橙皮素中含有易電離的酚羥基，因此在流動相中加入乙酸抑制電離，從而改善峰型。實驗發(fā)現(xiàn)，用甲醇和0.05%乙酸水溶液作為流動相，各物質(zhì)不能達到基線分離，而且色譜峰仍有拖尾現(xiàn)象；改用甲醇和0.5%乙酸水溶液(pH=3.03)后，峰形得到明顯改善，柑橘藥用資源樣品中的黃烷酮類物質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)良好分離。經(jīng)優(yōu)化后的洗脫程序見表2，在該條件下分離6種物質(zhì)混合標準品和樣品的的紫外色譜圖如圖2所示。

2.3 樣品峰定性和定量檢測波長選擇

在2.2所述分離條件下，用DAD掃描各物質(zhì)在190～400 nm間的紫外吸收，得到5個黃烷酮類物質(zhì)及川陳皮素的紫外光譜圖(圖3)。將樣品物質(zhì)峰的保留時間和紫外光譜圖與標準物質(zhì)峰對比，實現(xiàn)對樣品峰的定性分析，同時作峰純度檢測，以確認各目標物質(zhì)峰沒有或僅有微量其他成分共流出。由圖3還可知：蕓香柚皮苷在283 nm處有最大吸收，橙皮苷、柚皮苷在285 nm處有最大吸收，橙皮素、柚皮素在290 nm處有最大吸收，而川陳皮素在335 nm處有最大吸收。因此分別選擇283、285、290、335 nm為上述6個物質(zhì)的定量檢測波長。

表2 HPLC流動相梯度洗脫程序

圖2 柑橘類黃酮混合標準品色譜圖和柑橘藥用資源樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the mixed flavonoid standard solution and citrus medicinal resources samples注：1-蕓香柚皮苷；2-柚皮苷；3-橙皮苷；4-柚皮素；5-橙皮素；6-川陳皮素；A-陳皮；B-橘絡(luò)；C-青皮；D-化橘紅；E-橘核；顯示波長：285 nm。Note:1-Narirutin;2-Naringin;3-Hesperidin;4-Naringenin;5-Hesperetin;6-Nobiletin;A-Chenpi;B-Juluo;C-Qingpi;D-Huajuhong;E-Juhe,;Ultraviolet wavelength:285 nm.

2.4 線性關(guān)系和檢測限

將各標注物質(zhì)儲備液分別稀釋至10.0、15.0、20.0、30.0、100.0、200.0 μg/mL，測量不同濃度的標樣所對應(yīng)的峰面積，計算回歸方程。測定儀器信噪比(S/N)，當(dāng)各標準溶液稀釋至信噪比3

2.5 重復(fù)性、穩(wěn)定性和精密度

取同一批實驗樣品按照1.3.2進行樣品處理，配制試樣6份，按照表2的流動相洗脫程序進行含量測定，進行精密度和重復(fù)性實驗。結(jié)果顯示各物質(zhì)RSD在0.49%～2.55%(表4)，表明精密度和重復(fù)性良好。

將陳皮樣品提取液放置于室溫下，分別在24、48、72 h測定各類黃酮成分的含量，以研究其穩(wěn)定性。如表5所示，提取液中蕓香柚皮苷濃度呈緩慢地上升趨勢，72 h升高了約1.7%；柚皮苷含量在72 h內(nèi)呈緩慢下降趨勢，約降低了0.02 mg/g。橙皮苷、柚皮素和橙皮素含量變化趨勢不明顯，而川陳皮素的含量在72 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限

注：A為峰面積，單位mAU；C為濃度，單位μg/mL。

Note:A is the peak area in mAU;C is the concentration in μg/mL.

2.6 加標回收率實驗

準確稱取相同質(zhì)量的同一批次陳皮樣品兩份，一份用來測定本底含量，另一份加入已知量的川陳皮素和黃烷酮類物質(zhì)標準品，按照1.3.2項下的方法制備供試品溶液，按2.1、2.2項下條件測定，通過實際測得加入標準物質(zhì)的量除以已知加入量計算回收率，并計算相對標準偏差，結(jié)果如表6所示，各物質(zhì)的回收率為95.83%～103.56%。

圖3 6個類黃酮標準品的紫外光譜圖Fig.3 UV spectra of six flavonoids注：1-川陳皮素；2-蕓香柚皮苷；3-橙皮苷；4-柚皮苷；5-橙皮素；6-柚皮素；橫坐標為波長，單位nm；縱坐標為紫外信號的相對響應(yīng)值。Note:1-Nobiletin;2-Narirutin;3-Hesperidin;4-Naringin;5-Hesperetin;6-Naringenin;the abscissa is the wavelength in nm;the ordinate is the relative response of the ultraviolet signal.

表4 重復(fù)性實驗結(jié)果

2.7 柑橘藥用資源類黃酮含量

將5種柑橘藥用資源按照1.3.2和1.3.3處理和分析，結(jié)果如表7所示。所選柑橘藥用資源均含有蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素等4個黃烷酮類成分和川陳皮素；除橘核外，其他4種柑橘藥用資源中都檢出了柚皮苷。不同藥用資源所含優(yōu)勢黃烷酮化合物的類別有所差異。陳皮、青皮、橘絡(luò)和橘核中的優(yōu)勢成分是蕓香柚皮苷和橙皮苷，其中以青皮中蕓香柚皮苷含量最高(10.49 mg/g)，約為含量最低的橘核的40倍；陳皮中的橙皮苷含最高(10.78 mg/g)，是含量最低的橘核的10.5倍、化橘紅的3.6倍?；偌t的優(yōu)勢黃烷酮物質(zhì)為柚皮苷，其含量也為5種柑橘藥用資源中最高的，達到19.20 mg/g，是含量最低的陳皮的137倍；橘核中未檢出柚皮苷。

表5 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表6 加標回收率

表7 5種柑橘藥用資源中黃烷酮類成分和川陳皮素的含量

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一套同時準確分析檢測柑橘藥用資源中黃烷酮類成分和川陳皮素等類黃酮物質(zhì)含量的方法。采用70%乙醇浸提，將提取液稀釋后通過固相萃取除雜并濃縮，采用高效液相色譜分離6種目標物質(zhì)，利用紫外光譜結(jié)合保留時間做定性分析及色譜峰純度檢驗，采用外標法在各物質(zhì)的最大波長處測定其含量。結(jié)果表明：樣品稀釋液乙醇體積分數(shù)為5%時，利用SPE富集各類黃酮成分效率最高。對陳皮、青皮、化橘紅、橘絡(luò)和橘核等5種柑橘藥用資源進行了分析，結(jié)果表明：青皮中蕓香柚皮苷含量最高(10.49 mg/g)，化橘紅中柚皮苷含量最高(19.20 mg/g)，陳皮中的橙皮苷含最高(10.78 mg/g)；而柚皮素、橙皮素、川陳皮素在各柑橘藥用資源中含量較低。該方法的加標回收率為95.83%～103.56%，RSD為0.49%～2.55%，具有良好的精密度和重現(xiàn)性。該方法適用于常規(guī)HPLC對柑橘藥用資源中類黃酮的定性和定量檢測。